Утверждены
Министерством здравоохранения СССР
29 июля 1991 г. N 6106-91
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГЛУФОСИНАТ АММОНИЯ (БАСТА) В ВОДЕ И
РАСТИТЕЛЬНЫХ КУЛЬТУРАХ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.
Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.
1. Краткая характеристика
Глуфосинат аммоний (баста), XOE 039866-DL-гомоаланин-4-ил-(метил)-фосфонат аммония (по номенклатуре ИЮПАК).
O
│ - +
CH P-CH -CH -CH-COOH/ NH C H N O P.
3 2 2 │ 4 5 15 2 4
\\ NH
O 2 М.м. 198,19.
Белое кристаллическое вещество, температура плавления 215 °C.
Растворим в воде, нерастворим в органических растворителях. ОДУ в воде водоемов 0,02 мг/л.
Гербицид для борьбы с широким спектром одно- и многолетних двудольных и злаковых сорняков в овощеводстве, виноградарстве, садоводстве.
2. Методика определения глуфосината аммония (баста) в воде
и растительных культурах <*>
--------------------------------
<*> Примечание: методика разрабатывалась на яблоках различных сортов, кожуре цитрусовых, травянистой растительности, хвое, зерне, картофеле; при определении в других культурах необходимо предварительно провести анализ контрольной пробы исследуемого продукта.
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Метод основан на концентрировании водного экстракта, очистке и выделении глуфосината аммония на колонке с полисорбом и определении препарата из аликвоты подготовленного экстракта хроматографией на пластинках "Силуфол" с обнаружением басты по реакции с нингидрином.
2.1.2. Метрологическая характеристика метода
Минимально детектируемое количество - 0,1 мкг.
Нижний предел определения:
вода - 0,025 мг/л
растения:
овощи, фрукты - 0,1 мг/кг
зерно - 0,2 мг/кг
зеленая масса (травянистая растительность, хвоя) - 0,5 мг/кг
Размах варьирования, %:
вода - 70 - 102
растения - 66 - 105
Среднее значение определения, %:
вода - 87
растения - 83
Стандартное отклонение, %:
вода - 5,6
растения - 6,4
Доверительный интервал среднего при p = 0,95, n = 5:
вода +/- 15,6
растения +/- 18
Поправочный коэффициент, учитывающий потери при концентрировании вымораживанием до 2 - 3 мл, равен 1,2.
2.1.3. Избирательность метода
Определению не мешают другие ФОП, в том числе водорастворимые, глифосат фосфамид. Определению могут мешать водорастворимые коэкстрактивные вещества, содержащие аминогруппу. В связи с этим проводится ТСХ-анализ контрольного образца исследуемой культуры, как описано ниже (п. 2.5.1).
2.2. Реактивы и растворы
Ацетон, хч, ГОСТ 2603-79.
н-Гексан, хч, ТУ 6-09-3375-78.
Полисорб С-60/100, ТУ 6-05-211-1313-86.
Метанол, хч, ГОСТ 6995-77.
Аммиак водный, 25%, ч, ГОСТ 3760-79.
Этилацетат, хч, ГОСТ 22300-81.
Этанол 96%, ГОСТ 5962-81.
Медь сернокислая, чда, ГОСТ 19347-84, прокаленная при t = 160 °C до светло-голубого цвета.
Натрия хлорид, ч, ГОСТ 4233-77.
Диэтиловый эфир медицинский, ГОСТ 6265-74.
Вата обезжиренная (промытая эфиром).
Бинт или марля.
Глуфосинат аммоний с содержанием основного вещества не менее 99%.
Основной стандартный раствор (ОСР) глуфосината аммония: 100 мг вещества растворяют в 100 мл 1-процентного водного раствора аммиака. Раствор хранить в холодильнике не более 3-х месяцев.
Рабочие стандартные растворы 1 - 100, 2 - 10 мкг/мл, 3 - 1 мкг/мл готовят разведением ОСР 1-процентным раствором аммиака.
Растворы хранить в холодильнике не более 2-х недель.
Проявляющий реагент: 2-процентный раствор нингидрина в ацетоне. Хранить в темной склянке.
2.3. Приборы и посуда
Аппарат для встряхивания АВУ-1, ТУ 64-11081-83.
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М с набором колб, ТУ 25-11-917-74.
Вакуумный водоструйный насос.
Колба Бунзена емк. 250 мл, ГОСТ 25336-82.
Воронка Бюхнера, d = 75 мм, ГОСТ 9147-80.
Электроплитка с закрытой спиралью.
Холодильник бытовой с морозильной камерой.
Колбы конические, 250, 50 мл, ГОСТ 25336-82.
Колбы мерные, 100, 50 мл, ГОСТ 1770-74.
Цилиндры мерные,50,100 мл, ГОСТ 1770-74.
Пробирки мерные, 10 мл, ГОСТ 1770-74.
Выпарительные чашки 40 - 50 мл, ГОСТ 9147-80.
Колонки хроматографические, альфа = 18 мм, высота 20 см.
Пипетки на 1 - 10 мл, ГОСТ 1770-74.
Микропипетки на 0,1; 0,2 мл, ГОСТ 1770-74, или дозаторы пипеточные на 0,1; 0,2 мл, III, ТУ 84-1-3329-81, или шприц на 1 мл.
2.4. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб для определения микроколичеств пестицидов в сельскохозяйственной продукции, продуктах питания и объектах окружающей среды", утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979, N 2051-79.
2.5. Проведение определения
2.5.1. Экстракция глуфосината аммония из воды и растений
Вода. 200 мл анализируемой пробы помещают в круглодонную колбу
емкостью 500 мл. Присоединяют колбу к ротационному испарителю,
помещают ее в баню с мелко раздробленным льдом с солью (10:3) <*>.
Вращают колбу на ротационном испарителе (без включения вакуума),
чтобы вода в колбе начала кристаллизоваться. Кристаллизацию
проводят до тех пор, пока в колбе не останется ~= 20 мл воды.
Оставшуюся воду переносят в отгонную колбу емкостью 50 - 100 мл и
продолжают кристаллизацию до тех пор, пока в колбе не останется 2
- 3 мл. Быстро сливают воду в мерную пробирку (V ). Либо
1
оставшуюся воду (~= 20 мл) сливают в выпарительную чашку и
упаривают на кипящей водяной бане до объема ~= 2 мл. (Осторожно!
Не выпаривать досуха, чашку периодически ополаскивают водой,
оставшейся в чашке.) Переносят оставшуюся воду в мерную пробирку.
Измеряют объем (V ). Отбирают 1 мл пробы, прибавляют к нему 1 мл
1
этанола и 1 мл (1,2 г) прокаленной сернокислой меди, перемешивают,
дают отстояться и аликвоту 0,1 - 0,3 мл наносят на
хроматографическую пластинку.
--------------------------------
<*> Примечание: приготовленную смесь лед с солью можно повторно заморозить в холодильнике, чтобы использовать в дальнейшем.
Растительные продукты. Овощи, фрукты, траву измельчают до 0,5 - 1 см, зерно до 2 - 3 мм (отсеивают от муки) и отбирают среднюю пробу: овощи, фрукты - 100 г, трава - 20 г, зерно - 50 г. Пробу помещают в плоскодонную колбу и заливают точно измеренным объемом водыовощи, фрукты - 150 мл, траву, зерно - 100 мл. Встряхивают пробу в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Отбирают часть экстракта (овощи, фрукты - 80 - 90 мл, зерно, трава - 60 - 70 мл), фильтруя его под вакуумом водоструйного насоса в колбу Бунзена через двойной слой марли, вложенной в воронку Бюхнера. Из колбы Бунзена отбирают в цилиндр точно половину прибавленного к исследуемому образцу объема воды: овощи, фрукты - 75 мл (соответствует массе "P" - 50 г), трава, зерно - 50 мл (масса 10 и 25 г соответственно). Измеренный водный экстракт переносят в делительную воронку и промывают этилацетатом 2 x 30 мл; этилацетат (верхний слой) отбрасывают. Водный экстракт переносят в колбу для отгонки растворителей емкостью 100 - 150 мл и концентрируют вымораживанием до 2 - 3 мл, как описано для воды. Далее проводят очистку образца на колонке, как описано ниже.
Одновременно с анализируемым образцом подготавливают экстракт аналогичного контрольного образца.
Очистку экстрактов проводят на колонке с полисорбом.
Подготовка колонки. Колонку присоединяют к колбе Бунзена, соединенной с водоструйным насосом. В колонку помещают тампон из обезжиренной ваты, насыпают 15 куб. см полисорба, наливают 10 мл ацетона и включают водоструйный насос. Затем на слой полисорба помещают ватный тампон и промывают слой еще 40 мл ацетона при легком просасывании водоструйным насосом, чтобы полностью удалить ацетон. Затем насос отключают.
К подготовленному, как описано выше, экстракту (2 - 3 мл)
прибавляют 50 мл ацетона и хорошо перемешивают. Пропускают
полученный ацетоновый раствор через колонку под вакуумом
водоструйного насоса, промывают колонку 20 мл ацетона (под
вакуумом), затем 20 мл смеси ацетон - вода 9:1 (под вакуумом) и
весь элюат отбрасывают. Колбу отключают от вакуума, пропускают
через колонку 15 мл воды при прокапывании без отсоса. Когда над
слоем сорбента останется ~ 0,5 см воды, подключают колбу с
колонкой к водоструйному насосу. Сливают элюат из колбы в мерную
пробирку и измеряют точно объем - V - (должно быть ~ 10 мл).
1
Отбирают 1 мл экстракта, прибавляют к нему 1 мл этанола и 1 мл
(1,2 г) прокаленной сернокислой меди, перемешивают, дают
отстояться и аликвоту 0,1 - 0,2 мл анализируют методом ТСХ.
Примечание: можно (за исключением образцов, содержащих крахмал, например картофеля, зерна) вместо концентрирования вымораживанием использовать только способ концентрирования упариванием, но при этом использовать небольшие выпарительные чашки, а пробу доливать в чашку по мере упаривания. Упаривать осторожно, чтобы остаток в чашке каждый раз был не менее 2 мл. При этом способе концентрирования перед очисткой на колонке экстракт в чашке (2 - 3 мл) охлаждают 10 минут в холодильнике (t +4 - 6 °C). К охлажденному экстракту прибавляют ацетон, как описано ниже.
Одновременно готовят элюат контрольного образца. Из полученного контрольного элюата (10 мл) отбирают в две пробирки по 1 мл, в одну из которых прибавляют микропипеткой 1 мкг глуфосината аммония (0,1 мл рабочего стандартного раствора 2). Если нет возможности подготовить экстракт контрольного образца (см. п. 2.1.3), то обязательно от полученного элюата исследуемого образца отбирают 1 мл и прибавляют в него микропипеткой 1 мкг глуфосината аммония. Далее прибавляют по 1 мл этанола и поступают, как описано выше для исследуемого образца.
2.5.2. Тонкослойная хроматография
Пластинку "Силуфол" размером 15 x 15 см делят на 5 полосок
шириной 3 см. С нижнего края пластинки, на расстоянии 1,5 см от
края, по центру каждой полосы наносят микропипеткой (шприцом) или
пипеточным дозатором по 0,2 мл контрольного элюата, элюата с
внесенным глуфосинатом аммония, элюата исследуемого образца, 0,2
мл рабочего стандартного раствора 3, что соответствует 0,2 мкг, и
0,1 мл рабочего стандартного раствора 2, что соответствует 1 мкг.
Пластинку при нанесении проб и стандартов для более быстрого
испарения воды можно подогревать на электрогрелке. Когда вода
испарится, пластинку помещают в хроматографическую камеру, в
которую налита смесь метанол - аммиак (7:3). Дают растворителю
подняться на 10 см от старта и вынимают пластинку из камеры.
Помещают ее под УФ-свет на 25 минут, располагая на расстоянии 20
см от источника света. После облучения опрыскивают пластинку
проявляющим реагентом и помещают на 1 мин. в сушильный шкаф при
температуре 40 °C. Затем вынимают из шкафа и оставляют при
комнатной температуре (исключить прямое попадание солнечного
света). Через 5 - 7 минут проявляются сиренево-красного цвета
пятна глуфосината аммония с R 0,7 +/- 0,5, в том числе стандарт,
f
внесенный в контрольный экстракт (или элюат исследуемого образца).
Сразу после проявления стандартов проводится оценка содержания
пестицида в исследуемом образце.
Примечание: при увеличении температуры и времени прогрева, а
также при более длительном хранении (уже после проявления
стандартов) в некоторых образцах проявляются коэкстрактивные
вещества с R 0,68 +/- 0,05 и 0,72 +/- 0,05, 0,5 +/- 0,05.
f
2.6. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводится путем визуального
сравнения интенсивности окраски и размера пятен пробы и пятен
стандартных растворов. При этом следует обратить внимание на пятно
стандарта, содержащего 0,2 мкг, и пятно, где 0,2 мкг внесено в
пробу. Наиболее точно (ошибка +/- 11%) количественная оценка
достигается при концентрациях 0,2 - 1 мкг. При большем содержании
баста в исследуемом образце необходимо разбавить элюат (исходный
объем V = 10 мл) и повторить ТСХ-определение, как описано выше в
1
п. 2.5.2.
Расчет результатов содержания баста в образце проводят по
следующей формуле:
A x V x B x K
1
X = --------------,
V x P
2
где:
X - содержание баста в образце, мг/кг;
A - содержание баста, найденное в образце на пластинке, мкг;
V - общий объем водного элюата, мл;
1
B - кратность разведения V ;
1
V - объем этанольного экстракта, нанесенного на пластинку,
2
мл;
P - масса анализируемой пробы, мл или г (для растений с учетом
взятой аликвоты соответствует 1/2 навески);
K - коэффициент, учитывающий потери при концентрировании
вымораживанием до объема 2 - 3 мл, равен 1,2.
3. Техника безопасности
Соблюдаются обычные требования по технике безопасности, необходимые при работе с органическими растворителями, кислотами и щелочами.