Путь:
Навигация
- Декреты СССР 1917-1992
- Законы СССР 1917-1992
- Инструкции СССР 1917-1992
- Обращения СССР 1917-1992
- Письма СССР 1917-1992
- Положения СССР 1917-1992
- Постановления СССР 1917-1992
- Правила СССР 1917-1992
- Приказы СССР 1917-1992
- Прочие СССР 1917-1992
- Распоряжения СССР 1917-1992
- Указы СССР 1917-1992
- Циркуляры СССР 1917-1992
Язык [ РУССКИЙ ]
Новые материалы
- Геноцид собственного народа или зеленская чума 21 века 2024-04-27
- Бизнес-ланч как организовать обед с выгодой 2024-03-23
- Болезни, которые успешно лечатся в современных клиниках 2024-03-10
- Пополнить Steam Пополнение Счета через Steam 2024-03-05
- 10 способов оптимизации пространства в маленькой ванной 2024-02-03
- Магия звука выберите подходящий музыкальный инструмент для вашего творчества 2024-01-22
- Куда можно поехать отдохнуть в России 2024-01-22
- Преимущества доставки еды комфорт, разнообразие и экономия времени 2024-01-14
- Все что нужно знать о покупке земли 2024-01-14
- NATO-УГРОЗА СТАБИЛЬНОСТИ И БЕЗОПАСНОСТИ УКРАИНЫ 2023-12-05
- Займ Бесплатно на Карту Онлайн. Финансовая Гибкость и Удобство в Одном Клике 2023-11-30
- Преимущества краткосрочного займа на карту 2023-11-27
- Украине уже пора снять розовые очки и оценить, что значит война, нацизм и терроризм 2023-11-03
- юрии 0000-00-00
- Понимание основ охраны труда 2023-10-11
Картинка недели
Указы СССР 1917-1992
Категории
Методические указания по определению остаточных количеств препарата вирин-диприон на растительных объектах иммунофлюоресцентным методо
Дата публикации: До 2014-05-28Просмотров: 675
Материал приурочен к дате: 1983-05-12
Прочие материалы относящиеся к: Дате 1983-05-12 Материалы за: Год 1983
Автор: Мета Гость
Утверждены
Минздравом СССР
12 мая 1983 г. N 2799-83
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПРЕПАРАТА ВИРИН-ДИПРИОН
НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ
Характеристика препарата. Вирусный препарат вирин-диприон
предназначен для борьбы с личинками рыжего соснового пилильщика
(РСП) I - III возрастов. Действующее начало препарата - вирус
ядерного полиэдроза (ВЯП) кишечного типа, содержащийся в
тельцах-включениях (полиэдрах). Препарат жидкой формы представляет
собой концентрат-суспензию полиэдров темно-серого цвета с
беловатым осадком при отстое, состоящим главным образом из
полиэдров. Размер полиэдров колеблется от 0,5 до 4 мк, титр 1 x
10
10 пдр/мл. Применяется путем наземного или авиационного
опрыскивания сосновых насаждений, пораженных вредителями.
Принцип метода. ИФ-метод выявления остаточных количеств вирусного препарата основан на явлении иммунофлюоресценции, широко используемом в медицинской вирусологии для идентификации микроорганизмов. В основе метода лежит специфическая реакция взаимодействия антигена (в данном случае полиэдров ВЯП рыжего соснового пилильщика) с антителами, меченными флюоресцирующим красителем ФИТЦ. Реакция выявляется при наблюдении в люминесцентном микроскопе в виде специфического свечения комплекса антиген - антитело (яркое желто-зеленое свечение полиэдров).
Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно
2
определить от 1 x 10 и более полиэдров в 1 мл субстрата.
Избирательность метода. При условии применения качественных гипериммунных антиполиэдренных сывороток и устранения неспецифического свечения в исследуемых препаратах метод расценивается как специфический и высокочувствительный. При условии централизованного изготовления специфической антисыворотки ИФ-метод является экспрессным.
Отбор проб. Если проба состоит из мелких растительных объектов
(хвоя, трава, листья, ягоды), из них готовят навеску 200 - 300 г,
помещают в широкогорлые банки, доливают 200 - 300 мл
физиологического раствора с pH 7,4 - 7,6, энергично встряхивают 10
- 15 мин., отстаивают 10 мин., надосадок центрифугируют при
-1
скорости вращения 5 тыс. мин. , осадок ресуспендируют в 1 мл
дистиллированной воды. Для дальнейшей работы суспензию можно
хранить при температуре 4 °C до 3 сут.
Реактивы и материалы, приборы и посуда. Люминесцирующая ослиная сыворотка против глобулинов кролика, изготовленная Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. Иммунная специфическая кроличья сыворотка против полиэдров ВЯП РСП. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат. Дистиллированная вода. Физиологический раствор (0,15 М NaCl) с pH 7,4 - 7,6. Ацетон. Мертиолат натрия или борная кислота. Синька Эванса. Антибиотики - пенициллин, стрептомицин, 5-нитрооксихинолин. Люминесцентный микроскоп марки МЛ-2 или МЛ-3. Центрифуга ПЛС-1 и др. Пипетки градуированные на 1 и 5 мл. Чашки Петри. Предметные стекла.
Подготовка к определению. Основные реагенты в данном определении - иммунная сыворотка против ядерного полиэдроза рыжего соснового пилильщика, являющегося действующим началом препарата вирусного инсектицида вирин-диприон, а также меченная ФИТЦ сыворотка против глобулинов кролика. Последняя сыворотка изготовляется в Институте им. Н.Ф. Гамалеи. Что касается иммунной сыворотки, то для проведения анализа рекомендуется самостоятельно изготовить антисыворотку к полиэдрам из препарата вирин-диприон по следующей схеме.
Полиэдры для иммунизации животных извлекают непосредственно из препарата вирин-диприон, можно получать их из больных гусениц соответствующего вида. Очистку и концентрацию полиэдров ведут методами дифференциального центрифугирования и в градиенте плотности сахарозы.
Взвесь полиэдров за сутки до введения животным обрабатывают
антибиотиками из расчета 500 - 1000 ед. стрептомицина и
пенициллина и 20 мкг/мл 5-нитрооксихинолина. Перед иммунизацией
взвесь стерильно отмывают от антибиотиков, полиэдры ресуспендируют
в стерильном физиологическом растворе. Титр инокулята обычно
9
составлял 1 x 10 пдр/мл. Приготовленным антигеном иммунизируют
беспородных кроликов массой по 2,5 - 3 кг по следующей схеме.
Инъекции проводят внутривенно трижды с недельным интервалом по 1,5
- 2,0 - 2,5 мл, реиммунизацию - через 4 недели внутривенно 2,5 мл.
Кровь берут через 10 дней после реиммунизации. Сыворотку хранят с
добавлением консерванта (мертиолат 1:10000) при -20 °C. Лучше
сыворотку лиофилизировать и хранить при 4 °C. В этих условиях
высушенная сыворотка сохраняет активность до 5 лет.
Ход анализа. Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 кв. см. Затем на стекло микропипеткой наносят 0,02 мл исследуемой суспензии, равномерно распределяя ее по отмеченной площади. Препарат подсушивают на воздухе, для фиксации опускают в ацетон на 15 мин., после чего окрашивают синькой Эванса для гашения неспецифического свечения. Используют синьку Эванса в разведении 1:10000 дистиллированной водой. Время обработки препарата синькой 10 мин., затем его промывают проточной водой и подсушивают, после чего он должен иметь слабо-голубую окраску. Затем на препарат наносят антиполиэдренную иммунную сыворотку против ВЯП РСП, предварительно разведенную 1:10 физиологическим раствором, помещают на 20 мин. при 37 °C во влажную камеру, затем смывают проточной водой, подсушивают на воздухе, после чего наносят ослиную меченную ФИТЦ сыворотку против глобулинов кролика в рабочем разведении, указанном на ампуле. Выдерживают 20 мин. в термостате при 37 °C во влажной камере с последующим промыванием в проточной воде. Подсушенный препарат готов к просмотру в люминесцентный микроскоп. Препарат просматривают под иммерсией, используя нефлюоресцирующее иммерсионное масло, объектив 90, окуляр 8x. Полиэдры в препарате выявляются по специфическому свечению ярко-желто-зеленого ободка на общем красном фоне.
Контроль: а) препараты, приготовленные по той же схеме, но без обработки специфической иммунной сывороткой; б) препараты, обработанные обеими сыворотками, но заведомо не содержащие выявленных полиэдров. В контрольных препаратах свечения полиэдров не выявляется.
Обработка результатов анализа. Число полиэдров в 1 мл исследуемой суспензии (концентрат смыва со 100 кв. см поверхности или 200 - 300 г навески) M вычисляют по формуле:
aS
M = ---,
VS
1
где:
a - среднее число полиэдров в одном квадрате окулярной сетки;
S - площадь исследуемого мазка, кв. мм;
V - объем нанесенной на стекло суспензии, мл;
S - площадь квадрата окулярной сетки, кв. мм.
1
Полиэдры подсчитывают в 100 и более квадратах окулярной сетки.
Пример. Для анализа взяли навеску хвои 200 г с обработанного препаратом дерева, поместили в колбу. Добавили 200 мл подщелоченного физиологического раствора. Встряхивали 15 мин. Затем профильтровали, отцентрифугировали, ресуспендировали осадок в 1 мл дистиллированной воды. Из суспензии приготовили мазок на предметном стекле, как описано выше. При просмотре препарата в люминесцентном микроскопе подсчитали общее число полиэдров в 150 квадратах окулярной сетки:
SUM = 320, отсюда a = 320 : 150 = 2,13.
150
Площадь мазка известна: S = 20 мм x 20 мм = 400 кв. мм.
Сторона квадрата окулярной сетки равна 0,0062 мм (определили с
помощью объект-микрометра), т.е. площадь квадрата окулярной сетки
2
S = (0,0062) = 0,00004 кв. мм.
1
Объем нанесенной на стекло суспензии V = 0,02 мл.
9
Таким образом, M = (2,13 x 400) / (0,02 x 0,0004) = 1,1 x 10 ,
9
т.е. на 100 кв. см обследованной площади приходится 1,1 x 10
7
полиэдров, на 1 кв. см площади - 1,1 x 10 .
Требования безопасности. Соблюдаются меры безопасности, обычно рекомендуемые для работы с микроорганизмами IV группы.
Остальные материалы раздела: Указы СССР 1917-1992
Предыдущая Методические указания по определению остаточных количеств биопрепарата вирин-КШ на растительных объектах иммунофлюоресцентным методомСледующая Методические указания по определению действующего вещества препарата пликтран и его метаболитов оксида дициклогексилолова. циклогексил