Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
27 ноября 1984 г. N 3162-84
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА ПРЕПАРАТА ГИББЕРСИБ
В ВОДЕ И ПОЧВЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
1. Краткая характеристика препарата
Основное действующее начало препарата гибберсиб - натриевая соль
гиббереловой кислоты (или гибберелин А ).
3
O
//\/│
// /\│───┐ C H O Na.
│ CO │ │/ \ 19 21 6
│ │ │ │ │
/ \ / \ /│\ /│...OH М.м. 368.
HO │ │ └───┘=CH
CH COONa 2
3
Гибберсиб представляет собой мелкий однородный гигроскопичный порошок, получаемый высушиванием на распылительной сушилке продуктов метаболизма грибка Fusarium moniliforme Sheld. Гибберсиб является смесью натриевых солей гиббереловой, карбоновых кислот и карбоната натрия.
Растворимость гибберсиба в воде при 20 °C - 2 г/л. Растворим в этиловом и метиловом спиртах, этилацетате, ацетоне. Нерастворим в бензоле, гексане.
Применяется в качестве регулятора роста растений (томаты, виноград) в период цветения.
2. Методика определения действующего препарата гибберсиб
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Определение основано на экстракции гибберелинов из воды и почвы
этилацетатом с последующей тонкослойной хроматографией экстракта на
пластинках "Силуфол". Обнаружение гибберелина А проводят обработкой
3
пластинок 70-процентной серной кислотой и проявлением в УФ-свете.
2.1.2. Метрологическая характеристика метода
Диапазон определяемых концентраций - 0,05 - 0,5 мг/л в воде и 0,4 - 5
мг/кг в почве. Предел обнаружения препарата на пластинках - 3 мкг. Предел
обнаружения в воде - 0,05 мг/л, в почве - 0,4 мг/кг. Среднее значение
определения стандартных количеств гибберелина А : 74% - вода, 66% - почва.
3
Стандартное отклонение: вода - 12, почва - 9. Относительное стандартное
отклонение: вода - 16%, почва - 14%. Доверительный интервал среднего при p
= 0,95 и n = 5 для воды +/- 15 и для почвы +/- 14%.
2.1.3. Избирательность метода
Определению не мешают соли других гибберелинов А , А , А , А ,
4 7 9 14
неорганические компоненты и экстрактивные вещества из почвы.
2.2. Реактивы и материалы
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) ч, ГОСТ 8981-78.
Хлороформ медицинский, фармакопея СССР.
Метанол чда, ГОСТ 6995-77.
Кислота серная хч, ГОСТ 4204-77, 70-процентный раствор.
Аммиак водный технический, ГОСТ 9-77.
Гибберелин кристаллический (А ~ 80%), ТУ 64-3-103-75.
3
Натрий хлористый, ГОСТ 4233-77.
Уксусная кислота ледяная, ГОСТ 61-75.
Хроматографические пластинки "Силуфол" (ЧССР).
Стандартный раствор гибберелина А с содержанием 1000 мкг/мл
3
этилацетата.
2.3. Приборы, аппаратура и посуда
Ультрахемископ типа "Хроматоскоп".
Центрифуга типа ЦЛС-31М.
Ротационный испаритель ИР-1М или любой другой.
Весы аналитические типа ВЛР-200 (отсчет до 0,0001 г).
Весы технические типа ВЛТК-500.
Универсальная встряхивающая машина типа К-203 лабор. 2162.
Камера для хроматографии из комплекта КТХ-01 или сосуды цилиндрические типа СЦ.
Пульверизатор стеклянный.
pH-метр типа pH-262.
Воронка делительная типа ВД-1-250, ГОСТ 25336-82.
Колбы типа КнКШ-100, 250-29/32, ГрКШ-10-14/23, ГОСТ 25336-82.
Пипетка 1-1-1, ГОСТ 20292-74.
Линейка измерительная металлическая, ГОСТ 427-75.
Микрошприц 100 мкл.
Капилляры стеклянные.
Сито с отверстиями 1 мм.
2.4. Подготовка к определению
2.4.1. Приготовление системы растворителей
Смешивают хлороформ с метанолом в соотношении 10:1 (система I) и хлороформ, метанол с уксусной кислотой в соотношении 10:1:0,1 по объему (система II).
2.4.2. Отбор проб
Отбор пробы производится в соответствии с Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (МЗ СССР, ГСЭУ, Москва, 1980 г., N 2051-75 от 21.02.79).
Анализы производят в день отбора проб или на следующий день.
2.5. Проведение определения
2.5.1. Экстракция гибберелина
Вода. К 200 мл воды приливают 80 мл 0,5% раствора аммиака, смешивают на встряхивающей машине в течение 15 мин. и доводят pH раствора до 2,2 +/- 0,2. Затем приливают 25 мл насыщенного раствора хлористого натрия и экстрагируют в делительной воронке этилацетатом порциями по 50, 40, 40 мл. Этилацетатный экстракт освобождают от воды на центрифуге (10 мин. при 5000 об./мин.) и упаривают до объема ~ 0,1 - 0,2 мл.
Почва. Почву просеивают через сито с отверстиями 1 мм. К 100 г почвы приливают 80 мл 0,5-процентного раствора аммиака, гомогенизируют в течение 15 мин. на встряхивающей машине и осаждают на центрифуге в течение 10 мин. при 5000 об./мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок промывают 30 мл 0,5-процентного раствора аммиака, еще раз центрифугируют. Объединяют обе порции и доводят pH до 2,2 +/- 0,2. Приливают 25 мл насыщенного раствора хлористого натрия и экстрагируют в делительной воронке этилацетатом порциями по 50, 40, 40 мл. Этилацетатный экстракт освобождают от хлопьев и воды на центрифуге (при 5000 об./мин., 10 мин.). Экстракт сливают, отделяя воду на делительной воронке, а осадок промывают 10 мл этилацетата, еще раз центрифугируют, объединяют с экстрактом и упаривают до объема ~ 0,1 - 0,2 мл.
2.5.2. Хроматографирование и проявление
Экстракт из воды. Упаренный экстракт количественно наносят на
хроматографическую пластинку (диаметр пятна 10 - 12 мм) при помощи пипетки
с оттянутым концом, капилляром или микрошприцем и параллельно наносят
стандартный раствор (3 - 20 мкг), подсушивают на воздухе и хроматографируют
в системе растворителей I (хлороформ - метанол 10:1 по объему). После
окончания хроматографирования пластинки подсушивают под тягой и опрыскивают
из пульверизатора 70-процентной серной кислотой. Хроматограммы
рассматривают в УФ-свете. Обводят контуры пятен, соответствующих
гибберелину А в пробе и стандарте.
3
Экстракт из почвы. На хроматографическую пластинку в левый угол на расстоянии 15 - 20 мм от края пластинки наносят упаренный экстракт из почвы (диаметр пятна 10 - 12 мм) и хроматографируют в системе II (хлороформ - метанол - ледяная уксусная кислота 10:1:0,1). После того как фронт растворителя дойдет до края пластинки, ее извлекают из хроматографической камеры, поворачивают на 90° и помещают в ту же систему для хроматографирования. Так же поступают со стандартным раствором, нанесенным на другую пластинку. После хроматографирования пластинки обрабатывают серной кислотой, как указано для воды.
2.6. Обработка результатов анализа
С помощью линейки или миллиметровой бумаги измеряют размеры пятен на хроматограммах проб и стандартных растворов, вычисляют их площади.
Содержание гибберелина А в мг/л или мг/кг вычисляют по формуле:
3
A x S
2
C = ------,
S x P
1
где:
A - количество стандартного раствора, мкг;
S - площадь пятна на хроматограмме пробы, кв. мм;
2
S - площадь пятна на хроматограмме стандарта, кв. мм;
1
P - масса или объем пробы, взятые для анализа, г или мл.
3. Требования безопасности
Выполняются требования по технике безопасности, необходимые при работе в химических лабораториях.