Прочие СССР 1917-1992

 

Утверждаю

Заместитель начальника

Главного управления

научно-исследовательских

институтов и координации

научных исследований

Н.А.ДЕМИДОВ

11 июня 1976 года

 

КОМПЛЕКСНОЕ САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

 

Составители: Московский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт гигиены им. Ф.Ф. ЭрисманаКуйбышевский научно-исследовательский институт гигиены; Ростовский-на-Дону научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и гигиены.

 

1. ВВЕДЕНИЕ

 

За последние десятилетия санитарная микробиология достигла значительного прогресса. Подверглись ревизии многие устаревшие понятия об индикаторных микробах, введены новые показатели биологического загрязнения, проверенные и подтвержденные практикой, значительно усовершенствованы методы обнаружения и количественного учета многих индикаторных микробов, патогенных энтеробактерий и энтеровирусов в сточных жидкостях и поверхностных водах.

VII Всесоюзная конференция по санитарной микробиологии в г. Москве 11 - 12 декабря 1973 года в своем постановлении отметила, что "за последние годы расширяется выбор санитарно-показательных микроорганизмов, что позволяет в комплексе с непосредственным обнаружением патогенных микроорганизмов давать более полную и объективную оценку санитарно-эпидемиологического состояния объектов окружающей среды". Конференция считает, что "изучение санитарно-эпидемиологической характеристики объектов окружающей среды должно проводиться в широком комплексе с использованием возможно большего набора санитарно-показательных и патогенных бактерий и энтеровирусов с определением их количественных соотношений в различных условиях биоценоза". Все это имеет непосредственное отношение к оценке источника водоснабжения, поскольку существующие показатели и их нормативы уже не могут удовлетворить потребности практики в полной, реальной и объективной характеристике воды, поступающей на централизованное водоснабжение.

 

2. КОМПОНЕНТЫ КОМПЛЕКСНОЙ

САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ

 

Комплексная санитарно-микробиологическая характеристика поверхностных вод и источников централизованного водоснабжения складывается из следующих компонентов:

1. Общее количество аэробных метатрофных и мезофильных бактерий, определяемое при двух температурных режимах - 20° и 37°.

2. Аммонификаторы и нитрификаторы.

3. Бактерии группы кишечных палочек (преимущественно фекальные кишечные палочки и клебсиеллы).

4. Энтерококки (преимущественно фекальные стрептококки).

5. Протеи (преимущественно мирабильный протей).

6. Сульфитредуцирующие споровые анаэробы (преимущественно Cl. perfringens).

7. Бактериофаги кишечной палочки.

8. Сальмонеллы.

9. Энтеровирусы.

Набор показателей и объем комплекса определяется соответствующими показаниями к исследованию в зависимости от объекта и задач исследования санитарными врачами-эпидемиологами.

 

2.1. Общее количество аэробных метатрофных

и мезофильных бактерий

 

Этот показатель имеет не абсолютное, а относительное значение и рассчитывается по соотношению колоний, выросших при 37 °С, к количеству колоний на чашках, инкубированных при 22°. Подобное определение связано с экологической разницей сапрофитов, приспособившихся к пребыванию в условиях водоема с более средней температурой, и комменсалов человеческого и животного (теплокровных) организмов, способных развиваться и при температуре 37°. В местах массивных биологических загрязнений воды коэффициент приближается к единице, по мере удаления от источника загрязнения количество микробов, развивающихся при 37°, начинает уменьшаться, а развивающихся при 22° остается на одном уровне или даже увеличивается.

Следовательно, по этому коэффициенту можно судить об интенсивности процессов, происходящих в водоеме.

    2.1.1.  Ход исследования: в ряд чашек наливают по 1 мл исследуемой воды

                                                                   -2

и  ее  разведений (в зависимости от санитарной ситуации - до 1 х 10   - 1 х

  -6

10  ).  Каждый  объем (разведение) исследуют дублированно в четырех чашках.

Затем   чашку  заливают  расплавленным  и  остуженным  до  50  -  55°  2,5-

процентным питательным  агаром  в  количестве 10 мл и осторожными круговыми

движениями распределяют  агар  с посевным материалом по всей площади чашки,

после чего дают агару застыть (в возможно) горизонтальном положении.

2.1.2. По две чашки каждого исследуемого объема воды помещают в термостаты при температуре 30° и 43°. Учет (подсчет колоний) на чашках производят после инкубации при 30° через двое суток, после инкубации при 43° - через 16 - 20 часов.

2.1.3. Подсчет общего количества колоний производят, пользуясь счетной сеткой или трафаретом с квадратиками 1 кв. см. Подсчитывают количество колоний в 20 квадратиках, затем производят пересчет на 1 мл, исходя из общей площади чашки, при диаметре 9 см - 63,6 кв. см, при диаметре 10 см - 78,5 кв. см.

 

2.2. Определение аммонификаторов и нитрификаторов

 

    Для  определения  загрязнения воды поверхностных водоемов органическими

веществами   и   установления   степени   их  минерализации  и  применяется

определение   аммонификаторов   и  нитрификаторов.  Последние  определяются

титрационным  методом. Для поверхностных вод средней и малой загрязненности

                                                 -1          -5

производятся  посевы  1,0  и разведения от 1 х 10   до 1 х 10  . Для сильно

                                                           -1          -7

загрязненных поверхностных вод - 1,0 и разведения от 1 х 10   до 1 х 10  .

2.2.1. Для определения аммонификаторов применяют пептонную воду, разлитую по 9,0 мл в пробирках. После посева воды в пробирку под пробку вставляют лакмусовую бумажку. Пробку вместе с верхней частью пробирки закрывают полиэтиленовым колпачком. Результат учитывают по посинению лакмусовой бумажки на 10-й день при 37°.

2.2.2. Для определения нитрификаторов применяют среду Виноградского. Результаты учитывают на 10-й день. В пробирку добавляют по 1 мл реактива Грисса. Появившееся розовое окрашивание расценивается как положительный результат.

 

2.3. Бактерии группы кишечных палочек

и фекальные кишечные палочки

 

Рекомендуемое ГОСТ 2761-57 определение содержания кишечных палочек должно быть дополнено указанием, о каких именно кишечных палочках должна идти речь. "Кишечная палочка" - весьма неконкретное понятие, включающее многочисленную группу сходных по некоторым общим свойствам микроорганизмов, но имеющих различные биологические свойства, различную экологию и тем самым различное санитарное (индикаторное) значение. Наряду с безусловным показателем фекального загрязнения - E. Coli и Klebsiell (чаще в настоящее время в мировой санитарно-бактериологической литературе именуемой фекальной кишечной палочкой - ФКП) в эту группу входят виды, имеющие весьма относительное санитарное значение, - Эрвинии, Энтеробактеры, Цитробактеры. Колебания в соотношениях ФКП и прочих представителей группы ("бактерии группы кишечных палочек" - БГКП) колеблются в широких пределах - от 1:77000 до 1:1,4 в зависимости от сезона и от характера исследуемого водоисточника.

Если при контроле эффективности обеззараживания воды централизованного водоснабжения исследование на всю группу кишечных палочек отвечает задачам, поставленным перед этим исследованием - определить качество очистки и обеззараживания питьевой воды, то при исследовании поверхностных вод из всех представителей кишечных палочек следует выделить основного показателя биологического загрязнения - E. Coli, так как остальные представители группы в основном представляют обитателей внешней среды, способных длительное время сохраняться в воде и при подходящих условиях размножаться в последней.

Выявлению ФКП способствует ограничение всей группы представителями, объединяемыми одним признаком - способностью сбраживать лактозу с образованием газа. Этот признак, санитарное значение которого подтверждено в 1966 г. рядом авторов (Е.А. Можаев и Л.Е. Корш, Е.М. Дашкова, Г.П. Калина и А.Н. Бланкова, И.А. Кибальчич и Т.З. Артемова), принят также для определения БГКП в международном и европейском стандартах, а также в стандартах ряда зарубежных стран.

Замедленная иногда ферментация лактозы (до 48 часов) в большей степени относится к кишечным палочкам, подвергавшимся влиянию суббактерицидных доз хлора, и редко имеет место при исследовании поверхностных вод.

Преимуществом использования лактозного признака является возможность обходиться без оксидазного теста, поскольку ферментация лактозы крайне редко встречается у бактерий рода Aeromonas.

    2.3.1.   Ход   исследования   на   бактерии  группы  кишечных  палочек.

Титрационный    метод.    Для    титрации   в   жидких   средах   применяют

лактозо-пептонную  среду  с  индикатором  и  бродильными  трубками  в  трех

параллельных  рядах. Объемы исследуемой воды - 10,0 х 3; 1,0 х 3; 0,1 х 3 и

                               -5

далее  до  разведения  1  х  10    для  вод  малой  и средней биологической

                                                 -7

загрязненности  и от 0,1 х 3 до разведения 1 х 10   для сильно загрязненных

вод.

Объемы 10,0 мл вносят во флаконы в 100 мл среды, объемы 1,0 и по 1,0 последующих разведений в пробирки с 5,0 мл среды. Инкубация 24 часа при 37°. Индекс устанавливают по емкости, в которой обнаружен газ в бродильных трубках и изменение реакции среды в кислую зону. Для подтверждения наличия кишечных палочек производят высев на среду Эндо, на ней после 16 - 18-часовой инкубации при 37° определяют лактозоположительные кишечные палочки по красным с металлическим блеском и без блеска колониям. Бесцветные и розовые колонии во внимание не принимают. Расчет индекса БГКП производят по таблице (см. Приложение).

Метод мембранных фильтров. Воду разных объемов фильтруют через мембранные фильтры N 3. В зависимости от предполагаемой степени загрязненности воды фильтруют следующие объемы: 100,0 - 10,0 - 1,0 или 1,0 - 0,1 - 0,01. Объемы от <...> и меньше предварительно разводят с расчетом фильтрации не менее 10,0 мл. Фильтры помещают на поверхность Эндо и инкубируют при 37° 16 - 18 часов. Каждый объем дублируют и для определения индекса берут среднее, полученное при подсчете количества колоний на обоих фильтрах каждой пары. Для учета выбирают фильтры с количеством колоний не менее 10 и не более 50. Учитывают только колонии красные с металлическим блеском или без блеска.

2.3.2. Ход исследования на фекальные кишечные палочки. Фекальные кишечные палочки определяются на втором этапе исследования, одинаково при титрационном и мембранном методах. Из лактозо-пептонной среды, в которой после инкубации при 37° обнаружен газ, и с фильтров, на которых обнаружены красные с металлическим блеском или без блеска колонии, делается пересев в одну из двух элективных, специфичных для фекальных кишечных палочек сред:

а) лактозобуферную борнокислую среду;

б) лактозожелчную буферную среду.

В указанные среды высевают по одной петле с лактозного бульона или несколько красных с металлическим блеском и красных без блеска колоний с фильтров. Засеянную элективную среду инкубируют при 43° (первую среду) или при 44,5° (вторую среду) в течение 20 - 24 часов. Результаты определяют только по наличию газа в бродильных трубках в элективных средах. Помутнение (признаки роста) во внимание не принимают.

Определение индекса при титрационном методе - по таблице, при мембранном методе - по количеству колоний, пересев которых в элективные среды дал положительный результат. Так как проверить все красные колонии, выросшие на фильтрах, невозможно, индекс определяют по количеству красных с блеском или без блеска колоний, выборочная проверка которых в элективных средах дала положительный результат. Если не все колонии, отсеянные в элективные среды, дали положительный результат, то по соотношению таковых и колоний с отрицательным результатом производят расчет в отношении всех колоний, выросших на фильтре. Пример: выросло колоний на одном фильтре - 18, на втором - 40; все колонии - красные с металлическим блеском, но из числа отсеянных в элективные среды 6 колоний с первого фильтра и 8 колоний со второго фильтра положительный результат в элективных средах получен только в 2 из 6 и в 2 из 8. Следовательно, 4 из 14 колоний - фекальные кишечные палочки соответственно формуле 4 : 14 х 58 дает 16,6, что при пересчете на профильтрованный объем и даст индекс фекальных кишечных палочек.

 

2.4. Энтерококки и фекальные стрептококки

 

Индикаторное значение энтерококков давно доказано, они многими рекомендованы в качестве дополнительных, а иногда и более надежных показателей санитарно-эпидемиологического состояния водоема. Это легко определяемый микроб, он более устойчив к физическим и химическим воздействиям. Энтерококки больше соответствуют санитарному состоянию и эпидемиологической ситуации, хорошо коррелируют с находками патогенных энтеробактерий, размножаются, видимо, только при наличии в воде оптимальных температурных условий, когда можно ожидать и размножения патогенных энтеробактерий. Из двух основных видов энтерококков Str. faecalis, Str. faecium один - Str. faecalis и его разновидности являются, аналогично ФКП в группе кишечных палочек, показателями свежего фекального загрязнения (Г.П. Калина, 1974).

Для обнаружения и количественного учета энтерококков была предложена и апробирована в большом количестве исследований различных авторов (жидкая щелочно-полимиксиновая среда накопления) (Г.П. Калина, 1965), а для подтверждения наличия энтерококков, и в частности Str. faecalis и его наиболее существенного варианта Var. liguefacies, плотная молочно-ингибиторная среда (Г.П. Калина, 1972), на которой вырастают почти исключительно колонии энтерококков, различные у разных видов и не требующие дальнейших подтверждений, кроме микроскопии.

2.4.1. Ход исследования на фекальные стрептококки

Определяется только фекальный стрептококк как наиболее надежный из всей группы энтерококков индикаторный микроорганизм. Титрационный метод. Объемы - 3 по 100 мл, 3 по 10 мл и 3 по 1 мл для поверхностных вод средней и малой загрязненности, 3 по 1, 3 по 0,1 и 3 по 0,01 мл сильно загрязненных поверхностных вод. Посев в щелочно-полимиксиновую среду - объемы в 100,0 и 10,0 мл в среду двойной концентрации, остальные - в среду обычной концентрации. Инкубация при 37°. Предварительный учет и высев на сектора плотной молочно-ингибиторной среды через 24 часа, пробирки со средой накопления оставляют еще на 24 часа, после чего из пробирок, в которых вновь отмечено помутнение и изменение цвета среды, дополнительный высев на плотную подтверждающую среду.

На молочно-ингибиторной среде 24 часа отмечают наличие аспидно-черных колоний, круглых, с металлическим блеском. Колонии другой формы и характера - мелкие, серые или бесцветные во внимание не принимают. Отмечают также наличие вокруг колоний зон просветления, окруженных зоной увеличенного помутнения за счет выпадения параказеина (колонии Str. faecalis var. liguefacies - протеолитического энтерококка).

Метод мембранных фильтров. Ход исследования аналогичен исследованию мембранным методом бактерий группы кишечных палочек. В зависимости от степени загрязненности воды фильтруют 100,0 и 10,0 или 1,0 и 0,1 мл, а для сильно загрязненных вод - дополнительно 0,01 мл (разведение в 10 мл стерильной воды). После фильтрации фильтры помещают на молочно-ингибиторную среду с полимиксином, нистатином и биомицином. Инкубируют при 37° 48 часов. Подсчет колоний с вишнево-красным центром.

 

2.5. Протеи

 

Из всей группы протеев индикаторное значение имеют преимущественно Pr. mirabilis. Эти микробы не размножаются в воде, не содержащей больших количеств органических веществ (а в присутствии последних практически все индикаторные микробы, а возможно и патогенные энтеробактерии, также размножаются), они могут быть обнаружены в кишечнике 98% здоровых людей (Haenel и Dawidewsk, 1961) и в значительной степени отражают санитарное состояние водоема, в который поступают хозяйственно-фекальные сточные жидкости (Sturdza, 1963, Busila и Joannid, 1964). В фекальных сточных жидкостях именно этот вид протеев обнаруживается в преобладающих количествах (Г.П. Калина, 1971).

2.5.1. Ход исследования на мирабильный протей. Применяют только титрационный метод. Исследуют объемы - 3 по 100,0; 3 по 10,0; 3 по 1,0 мл и 3 по 0,1 мл, для сильно загрязненных вод дополнительно исследуют 3 по 0,01 и 3 по 0,001 мл. Объемы 100,0 и 10,0 вносят в среду накопления II - I двойной концентрации, остальные объемы - в ту же среду обычной концентрации. Инкубация при 37° 18 - 20 часов. Высев на сектора плотной среды П-2. Инкубация при 37° 20 - 24 часа. Колонии малинового цвета с черным центром свидетельствуют о наличии в данном объеме мирабильного протея. Практически дальнейшего подтверждения не требуется.

 

2.6. Споровые сульфитредуцирующие анаэробы,

преимущественно Cl. perfringens

 

Споровые анаэробы длительное время расценивались как показатели старого биологического загрязнения; при этом исходили из предположения, что споры этих микробов, поступая в окружающую среду, длительно сохраняются в последней. Однако индикаторное значение Cl. perfringens основано на том, что из кишечника человека и животных в окружающую среду поступают в основном вегетативные формы микроба, а для прорастания их спор вне организма должны создаваться определенные условия. В окружающей среде выживаемость спор клостридий относительно невелика.

2.6.1. Ход исследования на споровые сульфитредуцирующие анаэробы. Титрационный способ. Применяется при высоком содержании клостридий или их спор в исследуемом объекте, например, в месте выбросов очистных сооружений исследуют объемы 1,0 мл и разведения 1:10 и 1:100 в трех параллельных рядах. Посев в 10 мл среды Сидоренко-Пивоварова с 0,71% агара, предварительно растопленной и остуженной до 55°. Инкубация 16 - 18 часов при 46° (при необходимости учет может быть произведен и через 6 - 8 часов). Наличие почернения среды или отдельных шаровидных черных колоний в глубине агара свидетельствует о росте подозрительных на клостридии микробов. Для подтверждения роста - выборочная микроскопия колоний и посев в молочную среду. Наличие уже через несколько часов характерного губчатого сгустка подтверждает диагноз.

Параллельно можно исследовать пастеризованный материал. Пробирки с налитыми в них пробами или разведениями помещают в водяную баню при 60°, быстро поднимают температуру до 80°, выдерживают при этой температуре 5 минут, затем быстро охлаждают пробирки под струей холодной воды, затем в пробирки прибавляют растопленную среду.

Число колоний, выросших при исследовании пастеризованного материала, свидетельствует о наличии в материале только спор. Разность НВЧ непастеризованного и пастеризованного материала указывает на количество вегетативных форм, а частное от деления индекса вегетативных форм на общий индекс спор и вегетативных форм дает коэффициент содержания вегетативных форм в пробе. Чем выше этот коэффициент, тем более свежим можно считать биологическое загрязнение данного объекта. Свежевыделенные в окружающую среду фекалии дают 80 - 100% вегетативных клеток.

Мембранный метод. Применяют метод Graciadei-Celoria и модификацию Т.З. Артемовой. Фильтруют не менее 4-х объемов пробы (5,0 мл; 10,0 мл; 20,0 мл; 50,0 мл). После фильтрации фильтры помещают на дно чашки фильтрующей поверхностью вниз и заливают любой средой, предназначенной для выявления сульфитредуцирующих анаэробов, в количестве не менее 20 мл. Инкубация при 37° 18 - 24 часа. По Т.З. Артемовой фильтры, свернутые в трубочку фильтрующей поверхностью наружу, помещают в пробирки и заливают соответствующей агаризированной средой и инкубируют при 45° 24 часа. В качестве среды в той и другой модификации наиболее подходящей является среда Сидоренко-Пивоварова, агаризированная до 1,0 - 1,5% концентрации агара. В методе Грациадеи-Челория более эффективной является инкубация при 45 - 46°. В той и другой модификации требуется подтверждение принадлежности развивающихся черных колоний к виду Cl. perfringens. Из чашки агаровый блок целиком вместе с фильтром переносят на стерильную крышку чашки и колонии снимают для посева в молоко, определения подвижности в микроскопии (неподвижные, грубые, неуклюжие палочки с ровно обрезанными краями, как правило, в свежих культурах не содержащие спор). При модификации по Т.З. Артемовой для извлечения фильтра необходимо разрезать пробирку и извлечь агаровый цилиндр на стерильную чашку.

 

2.7. Бактериофаги кишечной палочки

 

Бактериофаги E. Coli в воде большинством расцениваются как косвенные показатели возможного присутствия в данном объекте энтеровирусов, устойчивость которых выше устойчивости других индикаторных микробов (кроме энтерококка) и близка к устойчивости фагов (Л.В. Григорьева, Г.А. Багдасарьян). Однако значение бактериофага E. Coli значительно возросло после того, как было показано, что существует высокая корреляция содержания в воде фекальных кишечных палочек и бактериофагов E. Coli. После соответствующей широкой проверки этот факт, возможно, позволит заменить определение индекса кишечных палочек более простым и быстрым (5 - 6 часов) методом количественного учета кишечного бактериофага.

2.7.1. Ход исследования. Для индикации бактериофагов используют заранее подобранный апатогенный штамм E. Coli. Практически индикация бактериофагов из воды проводится по методу Грация, который дает представление о количестве бактериофага в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 1 мл пробы. На наличие бактериофага исследуют 2 - 5 мл непосредственно отобранных из пробы воды или после концентрирования воды для выделения энтеровирусов. К 2 мл растопленного и охлажденного до 45° 0,7-процентного мясо-пептонного агара добавляют 1 мл пробы воды и 0,1 мл суточной культуры тест-микроба, размешивают вращением пробирки ладонями и распределяют по поверхности 1,5 - 2-процентного питательного агара в чашке. Для подавления роста грамм-положительной бактериальной флоры в агар добавляют 0,01-процентный водный раствор кристалл-виолета из расчета 2 мл на 100. Инкубация при 37°, учет возможен через 4 часа, при комнатной температуре - через сутки.

 

2.8. Сальмонеллы

 

Обнаружение и количественный учет патогенных энтеробактерий в воде и других объектах окружающей среды в последние годы достигли значительного успеха. Применение магниевой среды для выявления сальмонелл (Г.П. Калина и В.Л. Шиганова, 1972) среды из пивного сусла для выявления шигелл (Ю.Г. Талаева, 1967), увеличение доз посевного материала и дробление последнего на 5 или 10 небольших порций (В.Л. Шиганова и др., 1973; Г.П. Калина и др., 1974) обеспечили выявлению и учету этих микроорганизмов, особенно сальмонелл, высокую надежность. Сальмонеллы обнаруживаются в 100% проб сточных жидкостей, не подвергавшихся хлорированию (В.Л. Шиганова и Г.П. Калина, 1972; Э.В. Говоруха, 1970 и др.), в воде мелких водоемов, загрязняемых локальными сбросами хозяйственно-фекальных сточных жидкостей в 80 - 100% (В.Л. Шиганова и др., 1973; Г.П. Калина, 1974), даже в "чистой" по другим показателям Gallagher и Spino, 1968). Обнаружение и количественный в воде (Paoletti, 1964, Cherry и др., 1972, Fair и Morrison, 1967) учет сальмонелл в проточных водах является не только признаком угрожающей эпидемиологической ситуации, но и показателем биологического загрязнения, поскольку единственным источником сальмонелл в окружающей среде является кишечник человека и теплокровных животных. Наиболее часто сальмонеллы выделяются из воды с высокой бактериальной обсемененностью, но могут быть обнаружены и при низком содержании основных индикаторных микробов - бактерий группы кишечных палочек, фекальных кишечных палочек и энтерококков. Учет сальмонелл проводят по частоте их обнаружения (в процентах положительных проб) и по определению наиболее вероятного числа, определяемого по специальным таблицам. Количественный учет сальмонелл позволяет более четко определить степень эпидемиологической ситуации и массивность биологического загрязнения.

2.8.1. Ход исследования. Независимо от того, ставится ли задача обнаружения сальмонелл или определения их количественного содержания, исследуемую пробу делят на 5 - 10 порций. При качественном обнаружении это увеличивает вероятность получения положительного результата. Практически наиболее простым является исследование 1000 мл воды умеренного загрязненного водоема, разделенных на 5 порций по 200,0 мл. Если имеется подозрение в высокой обсемененности воды сальмонеллами, исследуют дополнительно 5 порций по 20 мл и 5 порций по 2 мл. Для чистых вод объем исследуемой пробы может быть увеличен до 2000 мл, разделенных на 10 порций по 200 мл. Практически наиболее экономным и удобным является так называемый "экспедиционный метод", при котором в исследуемую пробу воды вносят все ингредиенты магниевой среды соответственно прописи. Исследования показали, что смесь ингредиентов, являющаяся высоко концентрированной, становится свободной от грамм-отрицательных бактерий уже через несколько часов после ее приготовления, а возможное присутствие грамм-положительных бактерий не имеет значения, поскольку применяемая в среде концентрация бриллиантового зеленого достаточна для бактериостатического действия на грамм-положительную микрофлору.

После внесения в пробу смеси входящих в среду ингредиентов ее делят на соответствующее количество порций, которые помещают в отдельные емкости. Инкубация при 37° в течение 18 - 24 часов, после чего следует высев на плотную дифференциальную среду. Наиболее применима среда Вильсона и Блэр, которую инкубируют при 37° 24 и 48 часов. Подозрительные колонии высевают в среду СИТО-1, которую помещают при 43° на 4 - 5 часов в водяной бане. Из пробирок, в которых отсутствует резкое щелочение (уреаза) или кислотообразование (сбраживание лактозы или сахарозы), производят высев на среды СИТО-2 и СИТО-3, учет которых производят через сутки инкубации при 37°. Штаммы, показавшие на этих средах рост, характерный для сальмонелл, проверяют первоначально в реакции агглютинации на стекле с групповой А-В-С-Д-Е сывороткой. Если в этом есть необходимость, производится серотипаж выделенного штамма.

 

2.9. Вирусы

 

В настоящее время возрос удельный вес вирусных заболеваний в общей патологии человека. Отсутствие специфических мер борьбы против большинства известных вирусных инфекций значительно повышает необходимость разработки профилактических мероприятий, направленных на ограничение циркуляции вирусов во внешней среде. Накоплен значительный материал по распространению различных вирусов (более 100 типов) в воде водоисточников, что представляет реальную эпидемиологическую опасность и требует необходимости их учета в текущем и предупредительном надзоре. Непосредственное определение энтеровирусов в воде различной степени загрязненности наряду с индикаторными микроорганизмами повышает объективность биологической оценки водоема как с гигиенической, так и эпидемиологической точки зрения. Особое значение приобретают вирусологические исследования воды "благополучной" по широко употребляемым показателям, рекомендованным ГОСТом. Так, по данным проведенных натурных исследований получено, что в воде с низким содержанием кишечных палочек выделяются энтеровирусы. Наличие вирусов в воде свидетельствует об ее неблагополучии.

    2.9.1.  Ход  исследования.  Выделение  вирусов  из  воды  с  низким  их

содержанием   требует   исследования  проб  большого  объема.  Поскольку  в

клеточных   культурах  может  быть  исследована  проба  не  более  2-х  мл,

необходимым  этапом  является  концентрирование  вирусов за счет уменьшения

объема  исследуемой  пробы.  В  качестве  методов  концентрации  предложены

адсорбция  на  ионообменной смоле  АВ-17 (методические рекомендации НИИОиКГ

им.   А.Н.   Сысина,   1968)   и  ультрафильтрация  с  помощью  растворимых

лантан-алюминий  альгинатных ультрафильтров (методические рекомендации НИИГ

им.  Ф.Ф. Эрисмана, 1973).  В настоящее время работами, проведенными в НИИГ

им.   Ф.Ф.   Эрисмана,  совместно  с  институтом  полиомиелита  и  вирусных

энцефалитов  АМН  СССР  был  разработан метод концентрации с использованием

фильтров АФА (ткань Петрянова) и мембранных фильтров.

    В пробах воды, исследуемых  на  наличие вирусов, pH доводят до значения

3,0 HCl и фильтруют через фильтр АФА-В (ткань Петрянова) при  отрицательном

давлении, создаваемом  с  помощью вакуумного насоса. По окончании  процесса

фильтрации отработанный  фильтр  переносят  в  чистую  посуду, а  фильтрат,

собранный в стерильный  приемник, пропускают через мембранный фильтр. Перед

фильтрацией через мембранный фильтр в пробу  воды  вносят   0,35-процентный

раствор Na HPO  из  расчета  1  мл  на  100  мл  воды.  В  солевом растворе

          2   4

происходит более активная  адсорбция  вируса  на мембранном фильтре. Фильтр

(или фильтры)  от  каждой  пробы  по  окончании  фильтрования  переносят  в

стерильную посуду.

Снятие вируса с фильтров АФА и мембранный осуществляют с помощью элюирующего раствора, в качестве которого используют мясную воду или мясопептонный бульон со значением pH 8,0, установленной 1 N NaOH. К элюирующему раствору перед использованием добавляют антибиотики.

На фильтр с диаметром 35 мм наносят 2 мл элюирующего раствора, а с диаметром 70 - 100 мм - 5 мл. Колбы с фильтрами устанавливают на встряхивающем аппарате на 30 мин., после чего элюаты собирают в пенициллиновые флаконы. В случае отсутствия встряхивающего аппарата проводят тщательное пипетирование по поверхности фильтра и элюат также переносят во флаконы. Элюаты обрабатывают эфиром по общепринятой методике и хранят при температуре - 20° до исследования в клеточных культурах.

При наличии только одного из упомянутых типов фильтров - Петрянова или мембранных - для концентрации вируса используют однократную фильтрацию через имеющийся фильтр с последующей его обработкой по описанной методике и исследованием в культуре.

 

3. ПРИНЦИПЫ КОМПЛЕКСНОЙ САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ

ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД

 

Сущность комплексного обследования заключается не в простом суммировании данных, полученных при количественном учете разных климатических микроорганизмов, а в их сопоставлении с учетом климатической зоны, сезона, санитарно-топографического описания, санитарно-химических показателей. Известно, например, что в 3-м климатическом районе наиболее надежным индикаторным микробом весной является энтерококк, а осенью - фекальная кишечная палочка. Весной и летом в этом районе сальмонеллы дают наибольшую высеваемость, в значительной степени характеризующую санитарную обстановку. В 3-м климатическом районе максимальные индексы и наибольшая частота высеваемости сальмонелл приходятся на осень и в это время, а также зимой четкую санитарно-бактериологическую характеристику можно черпать из количественного учета протеев, особенно мирабильного протея.

Имеются основания считать, что по соотношению энтерококков и E. Coli можно определить источники биологического загрязнения; чем ближе коэффициент к единице, тем больше вероятности предполагать наличие фекального загрязнения воды, происходящего от животных. Те же источники можно определить и по преобладанию среди обнаруживаемых протеев мирабильного протея. О значении соотношения вегетативных и споровых форм сульфитредуцирующих анаэробов уже было упомянуто. Однажды полученная комплексная санитарно-микробиологическая характеристика определенного водоема или биотопа позволит в последующем выявить чувствительным образом отклонения от полученных параметров и малейшие качественные и количественные изменения всех использованных индикаторных микробов. Таким образом, вместе взятые, входящие в ассортимент индикаторные микробы обеспечат надежную и исчерпывающую характеристику воды открытых водоемов и особенно источников централизованного водоснабжения как с санитарной, так и с эпидемиологической позиций.

 

 

 

 

 

Приложение

 

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

 

(Приведены составы новых или малоизвестных питательных сред. Общеупотребительные среды не приводятся.)

 

    1.  Среда для аммонификаторов: водопроводной воды 10000 мл, пептона 5,0

г;  кипятить в течение 15 минут, в горячую среду прибавить K HPO  - 1,0  г;

                                                            2   4

KH PO  - 1,0 г; MgSO  х 7H O - 0,5 г; NaCl - следы. После растворения солей

  2  4              4     2

среду  фильтровать, разлить по 9 мл в пробирки, стерилизовать при 1 атм. 20

минут.

    2.  Среда  для  нитрификаторов  (Виноградского):  дистиллированной воды

1000,0 мл; (NH ) S O  - 2,0 г; K HPO  - 1,0 г; MgSO  х 7H O - 0,5 г; NaCl -

              4 2 2 4           2   4              4     2

2,0 г; FeSO  х 7H O - 0,4 гмела - небольшое количество.  Среду развести в

           4     2

10 раз дистиллированной водой, разлить  по  9  мл  в пробирки, обработанные

хромовой смесью. Стерилизовать при 1,5 атм. 20 минут.

3. Реактив ГриссаI. Разбавленной уксусной кислоты 150,0 мл; сульфаниловой кислоты 0,5 г. II. L-нафтиламина 0,1 г; воды 20,0 мл. После кипячения прибавить 150,0 мл разбавленной уксусной кислоты. Поместить в пробирку по 1,0 мл растворов I и II, кипятить, прибавить 10 мл исследуемой среды, вновь кипятить. В присутствии азотистой кислоты наступает красное окрашивание.

    4. Лактозобуферная  борнокислая  среда  (Левина):  пептона  -  10,0  г;

лактозы - 5,0 гK HPO  - 12,2 г; KH PO  - 4,1 г; борной кислоты -  3,5  г;

                  2   4             2  4

дистиллированной воды - 1000,0 мл; pH 7,0; разлить в пробирки с бродильными

трубками, стерилизовать при 6,5 атм. 20 минут.

    5.  Среда ЕС: пептона - 20,0 г; лактозы - 5,0 г; желчных солей - 1,5 г;

K HPO   - 4,0 г; KH PO  - 1,5  г;  NaCl - 5,0  г;  дистиллированной  воды -

 2   4             2  4

1000,0 мл; pH - 6,9.   Разлить   в   пробирки   с   бродильными   трубками,

стерилизовать при 0,5 атм. 20 минут.

    6.  Щелочно-полимиксиновая среда: А. Обычной концентрацииI. Бульона -

40,0  мл; NaCl - 0,5 гглюкозы - 1,0 г, дрожжевого экстракта - 2,0 мл. II.

Воды   дистиллированной  -  25,0   мл;   Na CO  -   0,53   г.   III.   Воды

                                           2  3

дистиллированной - 25  мл;  Na HPO   -  0,25  г.   Раздельная  стерилизация

                              2   4

растворов I, II, III при 0,5  атм. 12 минут.  После  стерилизации  растворы

смешать, проверить pH 10,0 - 10,2,  прибавить 20000 единиц полимиксина, 0,5

мл   1,6-процентного  спиртового  или  щелочного  раствора   бромтимолового

синего, разлить в пробирки по 5 мл. Б. Удвоенной концентрации: I. Бульона -

70,0  мл;  NaCl - 1,0; глюкозы - 2,0 г, дрожжевого экстракта - 4,0  мл. II.

Воды   дистиллированной   -   12,5   мл;   Na CO   -  1,1   г.   III.  Воды

                                             2  3

дистиллированной - 12,5 мл; Na HPO   - 0,5 г. Остальное  по  прописи  А, но

                              2   4

полимиксина   прибавить  40000  единиц  и  бромтимолового  синего  1,0  мл.

Разливать в колбы или флаконы   по   10,50   или  100,0  мл  соответственно

количеству исследуемой воды.

7. Молочно-ингибиторная средапитательного агара - 85,0 мл; стерильного снятого молока - 15,0 мл; 0,01-процентного водного раствора кристаллического фиолетового - 1,25 мл; теллурита калия - 0,02 г. Все хорошо смешать и разлить в чашки.

8. Та же среда с 200 ед./мл полимиксина, 10 ед./мл биомицина и 800 ед./мл нистатина.

9. Приготовление дрожжевого экстракта1000,0 г прессованных (пекарских) дрожжей распределить равномерно в 2000,0 мл дистиллированной воды, прогреть в автоклаве при 100° 3 минуты, оставить для отстаивания в холодильнике на 4 - 5 суток. Декантировать надосадочную жидкость, распределить во флаконы по 50 - 100,0 мл, прибавить на каждые 100,0 мл экстракта 1,25 мл 0,01-процентного водного раствора кристаллического фиолетового, вновь прогреть при 100° 30 минут. Хранить экстракт в холодильнике.

    10.  Среда П-1 (накопления для протеев): питательного бульона  -  100,0

мл; маннита - 0,1 г; желчной соли по Олькеницкому - 0,5 г; KH PO  - 0,08 г;

                                                             2  4

0,01-процентного  водного раствора  кристаллического  фиолетового - 2,5 мл;

1,6-процентного   щелочного  раствора  бромтимолового  синего - 0,2 мл;  pH

6,8 - 7,0стерилизация при 100° 15 минут,  затем  прибавить  0,8 - 1,0  мл

50-процентного  водного самостерилизующегося раствора  мочевины  и  10000 -

12000 единиц полимиксина.  Асептично  разлить  по  5  мл  в  пробирки.  Для

исследования больших объемов все  ингредиенты,  кроме  бульона,  удвоить  в

количестве  и  вносить  исследуемый  объект  в  равный  объем  среды.   При

исследовании объектов, сильно  обсемененных  энтерококками, кристаллический

фиолетовый   следует заменить  0,5  мл   0,1-процентного  водного  раствора

бриллиантового  зеленого. При  затруднениях  с  приготовлением желчной соли

последняя  может быть заменена (с некоторым ухудшением качества среды) 15 -

20 мл желчи (в этом случае введение бриллиантового зеленого обязательно).

11. Среда П-2 плотная дифференциальная для протеев: в растопленный 2,5-процентный питательный агар прибавить 2 - 3 мл дрожжевого экстракта, по 1,0 г мальтозы и маннита, 0,8 г желчной соли, 0,2 г лимонноаммиачного железа, 0,05 тиосульфата натрия, 2,5 мл 0,01-процентного водного раствора кристаллического фиолетового, 0,5 мл 1,6-процентного щелочного раствора фенолового красного; все растворить при кипячении в водяной бане в течение 5 - 10 минут, прибавить 10000 - 12000 единиц полимиксина и разлить в чашки. pH 7,1 - 7,2, среда должна иметь оранжевый цвет.

12. Приготовление желчной соли по Олькеницкому: к 1000,0 мл желчи прибавить 40,0 едкого натрия, гидролизовать в автоклаве при 1,5 атм. или два раза по 2 часа. Нельзя производить гидролиз в алюминиевой посуде. В гидролизат прибавить 100,0 мл 20-процентного водного раствора хлористого бария и прогреть в автоклаве при 100° 1 час. На следующий день слить жидкость с осадка и фильтровать. К профильтрованному гидролизату прибавить при постоянном помешивании 20-процентный раствор соляной кислоты до кислой реакции и оставить до следующего утра. Осадок промыть водой, прибавить при нагревании 40-процентный водный раствор едкого натрия до слабощелочной реакции и вылить на противень для подсушивания в сушильном шкафу при 115° до порошкообразного состояния. Из 1000,0 мл желчи можно получить до 36,0 г желчной соли.

13. Среда Сидоренко-Пивоварова (накопления для споровых сульфитредуцирующих анаэробов): питательной основы - бульона Вейберга, Хоттингера и др. 1000,0 мл 10-процентного раствора сернокислого закисного железа 10,0 мл; 10-процентного водного раствора сульфита натрия кристаллического 10,0 мл; 200000 единиц полимиксина и 50000 единиц неомицина. Разлить в стерильные пробирки по 9,0 мл.

14. Среда для учета клостридий путем подсчета колоний в глубине среды: к среде Сидоренко-Пивоварова прибавить 0,75-процентного агара.

15. Среда для учета клостридий мембранным методом: к среде Сидоренко-Пивоварова прибавить 1,0 - 1,25% агара. Мембранные фильтры после фильтрации поместить фильтрующей поверхностью вверх на дно чашки и залить толстым слоем среды. Для извлечения колоний агаровый блок вместе с фильтром вырезать, положить, перевернув на крышку чашки, и осторожно снять фильтр. На поверхности агара остаются черные колонии, которые и отсеиваются.

    16.   Магниевая   среда   (накопления   для   сальмонелл):  А.  Обычной

концентрации:  I.  Воды дистиллированной - 890,0 мл; дрожжевого экстракта -

20,0 мл; KH PO  - 1,5 г; NaCl - 7,0 г. II. Воды дистиллированной - 90,0 мл;

           2  4

хлорида магния кристаллического -  36,0  г.  III.  0,1-процентного  водного

раствора  бриллиантового  зеленого - 5,0  мл. Растворы I, II растворить при

кипячении в течение 10 минут, слить в одну колбу, прибавить раствор III. Б.

Двойной  концентрации:  все  ингредиенты удваивают,  кроме дистиллированной

воды.  В.  "Экспедиционная  модификация"  по  Г.Г. Калине: заранее готовить

навески  ингредиентов  хлорида, магния кристаллического 39,0 г; NaCl 8,0 г;

KH PO   безводного  1,6 г и растворы:  10-процентный раствор пептона - 50,0

  2  4

мл,   дрожжевой  экстракт - 22,0   мл   и   0,1-процентный  водный  раствор

бриллиантового зеленого - 5,0  мл.  Все  помещают  во  флакон  или  на  дно

емкости, в которую наливают 1000,0 мл исследуемой  воды  после  растворения

всех ингредиентов и тщательного смешивания смеси, разливают по флаконам  по

100,0 мл  (10  емкостей)  или  по  200,0  мл (5 емкостей); по 10,0 мл;  при

сильно обсемененной воде или сточных жидкостях  еще  по  1,0  мл  (2,0  мл)

дополнительно.

    17.  Среда  СИТО-1:  Воды дистиллированной - 100,0 мл; пептона - 0,5 г;

дрожжевого экстракта - 3,0  мл, NaCl - 0,5  г; лактозы и сахарозы по 0,5 г;

1,6-процентного  щелочного раствора бромэтилового синего - 0,3 мл; KH PO  -

                                                                     2  4

0,04  г,  K HPO   -  0,1  г  стерилизовать  при  0,5  атм.  20 минут, после

           2   4

стерилизации прибавить 4,0 мл  50-процентного самостерилизующегося раствора

мочевины и разлить асептично по 0,5 мл в маленькие пробирки. Возможно более

массивный  посев  подозрительной  колонии,  инкубация при 40° 4 - 5 часов в

водной  бане,  после  чего  для  последующего  исследования отбирать только

пробирки с посевами, в которых сохранился неизменным зеленый цвет среды.

    18.  Среда  СИТО-2  (для  определения подвижности,  декарбоксилирования

лизина,  образования  индола  и  сероводорода):  Состоит  из двух слоев: А.

Нижний   слой:   0,2-процентного  питательного  агара  и   0,02-процентного

лимонно-аммиачного  железа налить в пробирки по 2,5 - 3,0 мл, стерилизовать

при  1  атм. 10 - 12 минут и застудить в вертикальном положении. В. Верхний

слой:  дистиллированной  -  100,0  мл;  пептона  -  0,5  г; K HPO  - 0,1 г,

                                                             2   4

KH PO  - 0,04 г, тиосульфата натрия 0,05 глизина  1,0 г,  1,6-процентного

  2  4

щелочного раствора  бромэтилового  синего  0,3 мл. Стерилизовать при 1 атм.

20 минут, разлить  асептично вторым слоем по 2,0 мл в пробирки с застывшим

полужидким агаром.  Посев уколом до дна пробирки. Инкубация при 37° 16 - 18

часов. После учета результатов на поверхность верхнего слоя налить  0,2  мл

реактива   Ковача   (парадиметиламидобензальдегида  5,0  г;  амилового  или

изоамилового спирта 75,0 мл; концентрированной соляной кислоты 20,0 мл) для

определения индола. Определить индол можно сразу или еще  через  сутки  при

37°.

    19.  Среда  СИТО-3  (для  определения  ферментации дульцата и маннита и

газообразования  при ферментации этих углеводов): Нижний слойводы дистил.

100,0  мл;  агара 1,5 г: NaCl 0,5 г; пептона 1,0 г; маннита 0,5 г; K HPO  -

                                                                    2   4

0,2  г;   1,6-процентного  щелочного раствора бромтимолового синего 0,5 мл,

стерилизовать  при 0,5 атм. 20 минут. Разлить в пробирки. Пробирки остудить

в вертикальном положении. Верхний слой: МПА (2%) - 100,0  мл,  дульцит  1,0

ч., KH PO  - 0,1 г; 1,6-процентного щелочного раствора бромэтилового синего

      2  4

0,5 млстерилизовать при 0,5 атм. 20 мин. Перед посевом наслоить на нижний

слой по 3 мл, скосить по типу среды Ресселя; посев штрихом  по  поверхности

скоса и уколом в столбик.