Путь:
Навигация
- Декреты СССР 1917-1992
- Законы СССР 1917-1992
- Инструкции СССР 1917-1992
- Обращения СССР 1917-1992
- Письма СССР 1917-1992
- Положения СССР 1917-1992
- Постановления СССР 1917-1992
- Правила СССР 1917-1992
- Приказы СССР 1917-1992
- Прочие СССР 1917-1992
- Распоряжения СССР 1917-1992
- Указы СССР 1917-1992
- Циркуляры СССР 1917-1992
Язык [ РУССКИЙ ]
Новые материалы
- Бизнес-ланч как организовать обед с выгодой 2024-03-23
- Болезни, которые успешно лечатся в современных клиниках 2024-03-10
- Пополнить Steam Пополнение Счета через Steam 2024-03-05
- 10 способов оптимизации пространства в маленькой ванной 2024-02-03
- Магия звука выберите подходящий музыкальный инструмент для вашего творчества 2024-01-22
- Куда можно поехать отдохнуть в России 2024-01-22
- Преимущества доставки еды комфорт, разнообразие и экономия времени 2024-01-14
- Все что нужно знать о покупке земли 2024-01-14
- NATO-УГРОЗА СТАБИЛЬНОСТИ И БЕЗОПАСНОСТИ УКРАИНЫ 2023-12-05
- Займ Бесплатно на Карту Онлайн. Финансовая Гибкость и Удобство в Одном Клике 2023-11-30
- Преимущества краткосрочного займа на карту 2023-11-27
- Украине уже пора снять розовые очки и оценить, что значит война, нацизм и терроризм 2023-11-03
- юрии 0000-00-00
- Понимание основ охраны труда 2023-10-11
- Огурец Кибрия РЦ F1 лучший выбор для плёночных теплиц 2023-10-11
Картинка недели
Указы СССР 1917-1992
Категории
Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом утв. Минздравом СССР 22.05.1985 N
Дата публикации: До 2014-05-28Просмотров: 588
Материал приурочен к дате: 1985-05-22
Прочие материалы относящиеся к: Дате 1985-05-22 Материалы за: Год 1985
Автор: Мета Гость
Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
22 мая 1985 г. N 3891-85
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЛЕПИДОЦИДА НА ОБРАБОТАННЫХ
ИМ РАСТЕНИЯХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ
Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Агропрома СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.
Срок действия временных методических указаний устанавливается до утверждения гигиенических регламентов.
Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками Госагропрома СССР.
Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Марциновского Е.И. и Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.
1. Характеристика анализируемого инсектицида
Лепидоцид - бактериальный инсектицидный препарат для борьбы с листогрызущими насекомыми. Действующим началом препарата служат споры и продукты жизнедеятельности бактерий Bacillus thuringiensis Var. kurstaki.
Лепидоцид практически не токсичен для теплокровных животных: при
введении в желудок ЛД для белых мышей превышает 15 г/кг, для белых крыс
50
равна 9,7 +/- 1,9 г/кг. Споры Bac. thuringiensis Var. kurstaki в организме
теплокровных не прорастают и не вызывают инфекционного заболевания.
Концентрированные суспензии (1 - 5%) лепидоцида оказывают слабое кожно-раздражающее и кожно-сенсибилизирующее действие. В рабочих концентрациях (0,1%) суспензия лепидоцида раздражающим действием не обладает.
Препарат представляет собой аморфный порошок кремового цвета, имеющий слабый специфический запах. В воде образует нестойкую суспензию.
2. Методика определения лепидоцида
иммунофлюоресцентным методом
2.1.1. Принцип метода
В основу определения остаточных количеств лепидоцида на растениях положена реакция взаимодействия антигена из спор микроорганизма с мечеными флюоресцеином антителами и выявления спор в люминесцентном микроскопе по специфическому свечению. Использован непрямой иммунофлюоресцентный метод.
2.1.2. Метрологическая характеристика
Предел обнаружения: одна спора в 50 полях зрения, что соответствует
11 3
(при титре лепидоцида 10 спор/г) 0,01 мкг препарата на 1 г пробы или 10
спор на 1 г пробы. Среднее значение определения спор - 83,6% при пяти
исследованных параллельных пробах, среднее квадратическое отклонение -
6,8%. Доверительный интервал среднего при Р = 0,95 соответствует +/- 17,4%.
2.1.3. Избирательность метода
Метод специфичен при условии использования иммунных сывороток против спор микроорганизма, активных в разведении 1:160 - 1:640 и выше.
2.2. Реактивы и материалы
Этанол, 96%, ТУ 6-09-1710-77физиологический раствор (0,85% раствор хлористого натрия); мертиолатнефлюоресцирующее иммерсионное масло; сухая люминесцентная ослиная сыворотка против глобулинов кролика производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея, г. Москва; специфическая иммунная сыворотка кроликов против спор Bac. thuringiensis Var. kurstaki.
2.3. Приборы, аппаратура, посуда
Люминесцентный микроскоп марки МБИ-15У или другой, аналогичный названному; объект-микрометр; центрифуга до 12 тыс. об./мин.; термостат на 37 °С; шуттель-аппаратколбы; пробирки бактериологические; чашки Петри; предметные стекламикропипетки.
2.4. Подготовка к анализу
2.4.1. Приготовление специфических иммунных сывороток против спор Bacillus thuringiensis Var. kurstaki
Для получения специфической иммунной сыворотки проводят иммунизацию
кроликов однократной инъекцией в область подколенного лимфатического узла
суспензии спор чистой культуры Bacillus thuringiensis Var. kurstaki,
9
прогретой в течение одного часа на кипящей водяной бане, в дозе 10
микробных клеток на животное. Через месяц кроликов реиммунизируют второй
однократной инъекцией антигена из спор в область подколенного
лимфатического узла в той же дозе. Спустя месяц после реиммунизации
проверяют титр сыворотки в непрямой реакции иммунофлюоресценции. При титре
не менее 1:160 получают сыворотку в нужном количестве и используют для
проведения анализа. Сыворотки консервируют мертиолатом в соотношении
1:10000 или подвергают лиофильному высушиванию.
2.4.2. Определение титра специфической иммунной сыворотки
Из чистой культуры или из товарной формы препарата готовят взвесь спор
7
в физиологическом растворе в концентрации 10 спор/мл (из препарата готовят
суспензию в разведении 1:1000).
На сухие обезжиренные предметные стекла наносят по капле взвеси и готовят из нее мазки, равномерно распределяя каплю. После подсушивания на воздухе мазки фиксируют этанолом в течение 30 минут, обрабатывают иммунной сывороткой в разведении 1:10, 1:20, 1:40 и т.д. Далее препараты обрабатывают люминесцирующей ослиной сывороткой против глобулинов кролика, как описано ниже, просматривают в люминесцентном микроскопе и оценивают реакцию по интенсивности свечения спор.
Для контроля иммунологической специфичности готовят контрольные препараты:
а) обработанные только флюоресцирующей ослиной сывороткой против глобулинов кролика;
б) обработанные физиологическим раствором вместо иммунной сыворотки;
в) обработанные нормальной кроличьей сывороткой вместо иммунной.
За титр сыворотки принимают ее максимальное разведение, при котором еще отмечается четкое, "полыхающее" зеленое свечение спор. В контрольных мазках свечение спор отсутствует. Для анализа используют сыворотки, имеющие титр не менее 1:160. Рабочим разведением служат разведения, равные 1/2 титра, т.е. 1:80.
2.5. Отбор проб
Пробы для анализа отбирают согласно Унифицированным правилам отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденным Зам. Главного государственного санитарного врача СССР 21.06.1979 за N 2051-79.
Пробы отбирают в стерильные бумажные пакеты, сохраняют в прохладном месте (не выше +5 °С) и анализируют не позднее чем через 5 - 7 дней.
2.6. Проведение анализов
Для анализа 1 г листьев измельчают с соблюдением правил стерильности, добавляют 15 - 20 мл стерильного физиологического раствора и встряхивают в колбе на шуттель-аппарате в течение 20 минут. Смыв фильтруют через два слоя стерильной марли и ваты и центрифугируют при 12 тыс. об./мин. в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в 0,1 мл физиологического раствора. На предметные стекла наносят 0,01 мл суспензии и равномерно распределяют ее на площади 1 кв. мм. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют этанолом 30 минут. Затем наносят иммунную сыворотку против Bacillus thuringiensis Var. kurstaki в рабочем разведении и помещают во влажную камеру при температуре 37 °С на 20 минут. Влажную камеру создают путем помещения в чашку Петри фильтра, смоченного физиологическим раствором.
По истечении времени инкубации препараты промывают 1 - 2 минуты проточной водой, высушивают на воздухе, затем обрабатывают ослиной сывороткой против глобулинов кролика в ее рабочем разведении и оставляют в контакте с ней в течение 20 минут во влажной камере при 37 °С. Далее препараты промывают проточной водой 1 - 2 минуты, высушивают на воздухе и просматривают в люминесцентном микроскопе с иммерсионным объективом 90 х 1,25 и окуляр х4.
Одновременно готовят контрольные препараты из взвеси лепидоцида 1:1000 на физиологическом растворе и из проб, взятых на необработанном участке, которые обрабатывают по той же схеме.
Для анализа проб плодов (например, яблок) исследования проводят следующим образом: целый плод взвешивают, заливают определенным объемом стерильного физиологического раствора, достаточным для полного смачивания. Смыв проводят путем встряхивания сосуда с пробой на шуттель-аппарате в течение 20 минут. Смыв фильтруют, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в 0,1 мл физиологического раствора, готовят препараты на предметных стеклах и обрабатывают их сыворотками, как указано выше.
2.7. Расчет
С помощью объект-микрометра измеряют площадь поля зрения микроскопа при выбранном для работы увеличении. При использовании объектива 90 х 1,25 и окуляра х4 она равна 0,02 кв. мм.
На каждом мазке под иммерсией рассматривают 50 полей зрения, в которых подсчитывают все споры, имеющие яркое "полыхающее" зеленое свечение. Вычисляют среднее значение количества спор в одном поле зрения.
Расчет концентрации спор в 1 г листьев проводят по формуле:
а х S х V
Х = -----------,
V х S х М
1 1
где:
Х - число спор в навеске;
а - число спор в одном поле зрения;
S - площадь мазка на предметном стекле. По условиям методики -
1 кв. см, т.е. 100 кв. мм;
S - площадь одного поля зрения. При использовании объектива 90 х 1,25
1
и окуляра х4 она равна 0,02 кв. мм;
V - разведение = 0,1, т.к. осадок ресуспендируют в 0,1 мл;
V - объем суспензии, нанесенной на стекло. По условиям методики он
1
равен 0,01 мл;
М - масса пробы в граммах.
С учетом значений известных величин формула принимает такой вид:
5
а х 100 х 0,1 а х 10
Х = ----------------- = -------, спор в 1 г пробы.
0,01 х 0,02 х 1,0 2
Пример: масса пробы (М) = 1,0 грамма обработана, как описано в
методике, полученный осадок ресуспендирован в объеме (V) 0,1 мл, на площадь
(S) 100 кв. мм предметного стекла нанесено (V ) 0,01 мл суспензии.
1
Полученный препарат обработали по методике (п. 2.6). При просмотре
препарата в люминесцентном микроскопе количество спор в 50 полях зрения
составило 2192. Отсюда:
SUM 50 2192
а = ------ = ---- = 43,84.
50 50
Подставляя в формулу известное значение, получаем:
5
а х S х V 43,84 х 100 х 0,1 43,84 х 10 5
Х = ----------- = ----------------- = ----------- = 21,92 х 10 =
V х S х М 0,01 х 0,02 х 1,0 2
1 1
6
= 2,19 х 10 , спор в 1 грамме.
Расчет концентрации спор на плодах проводят по формуле:
а х S х V х 1000
Х = ----------------,
V х S х М
1 1
где значения а, S, S , V, V , М - те же, что и в формуле для листьев,
1 1
1000 - перерасчетный коэффициент для выражения результата на кг
обработанного продукта. После подстановки известных значений формула
принимает вид:
8
а х 10
Х = -------, спор/кг.
2М
Методику разработали:
Мельникова Е.А., Пляченко Е.А. (ВНИИГИНТОКС).
Остальные материалы раздела: Указы СССР 1917-1992
Предыдущая Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом утв. Минздравом СССР 22.05.1985 N 389Следующая Методические указания по определению триадимефона байлетона методом тонкослойной хроматографии в воде утв. Минздравом СССР 22.05.1985 N 3892-85