Путь:
Навигация
- Декреты СССР 1917-1992
- Законы СССР 1917-1992
- Инструкции СССР 1917-1992
- Обращения СССР 1917-1992
- Письма СССР 1917-1992
- Положения СССР 1917-1992
- Постановления СССР 1917-1992
- Правила СССР 1917-1992
- Приказы СССР 1917-1992
- Прочие СССР 1917-1992
- Распоряжения СССР 1917-1992
- Указы СССР 1917-1992
- Циркуляры СССР 1917-1992
Язык [ РУССКИЙ ]
Новые материалы
- Бизнес-ланч как организовать обед с выгодой 2024-03-23
- Болезни, которые успешно лечатся в современных клиниках 2024-03-10
- Пополнить Steam Пополнение Счета через Steam 2024-03-05
- 10 способов оптимизации пространства в маленькой ванной 2024-02-03
- Магия звука выберите подходящий музыкальный инструмент для вашего творчества 2024-01-22
- Куда можно поехать отдохнуть в России 2024-01-22
- Преимущества доставки еды комфорт, разнообразие и экономия времени 2024-01-14
- Все что нужно знать о покупке земли 2024-01-14
- NATO-УГРОЗА СТАБИЛЬНОСТИ И БЕЗОПАСНОСТИ УКРАИНЫ 2023-12-05
- Займ Бесплатно на Карту Онлайн. Финансовая Гибкость и Удобство в Одном Клике 2023-11-30
- Преимущества краткосрочного займа на карту 2023-11-27
- Украине уже пора снять розовые очки и оценить, что значит война, нацизм и терроризм 2023-11-03
- юрии 0000-00-00
- Понимание основ охраны труда 2023-10-11
- Огурец Кибрия РЦ F1 лучший выбор для плёночных теплиц 2023-10-11
Картинка недели
Указы СССР 1917-1992
Категории
Методические указания по определению гранул вируса гранулеза яблонной плодожорки на растительных объектах иммунофлюоресцентным методом
Дата публикации: До 2014-05-28Просмотров: 645
Материал приурочен к дате: 1981-03-30
Прочие материалы относящиеся к: Дате 1981-03-30 Материалы за: Год 1981
Автор: Мета Гость
Утверждены
Минздравом СССР
30 марта 1981 г. N 2352-81
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГРАНУЛ ВИРУСА ГРАНУЛЕЗА ЯБЛОННОЙ ПЛОДОЖОРКИ
НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ
Краткая характеристика препарата. Вирин-ГЯП - вирусный
энтомопатогенный препарат - вирусный инсектицид. Предназначается
для борьбы с гусеницами яблонной плодожорки в яблоневых садах.
Действующее начало препарата - вирус гранулеза семейства
бакуловирусов, находящийся в препарате в белковых
тельцах-включениях сферической формы (гранулах), образующихся в
клетках тканей больных вирозом гусениц. Размеры гранул 393,9 x
207,7 нм. Гранулы содержат одну, реже две вирусные частицы
(вирионы). Препарат - водная суспензия гранул с титром не менее
9
1 x 10 грн/мл. Применяется путем опрыскивания яблоневых деревьев
против гусениц всех возрастов.
Вирин-ГЯП не опасен для позвоночных животных с точки зрения
возможной инфекционности или токсичности при однократном или
множественном воздействии различных доз препарата. В связи с
низкой токсичностью ЛД не определяется. Пероральное введение
50
даже максимальных доз не приводит к гибели животных.
Принцип метода. Метод основан на специфической реакции взаимодействия антигена (гранулы) с антителами, меченными флюоресцирующим красителем (ФИТЦ). Реакция выявляется при наблюдении в люминесцентный микроскоп в виде специфического ярко-зеленого свечения комплекса антиген - антитело ободка гранул.
При условии изготовления качественных иммунных антигранулезных сывороток иммунофлюоресцентный метод является экспресс-методом, высокочувствительным и специфичным.
Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно
2 11
определить от 1 x 10 до 1 x 10 гранул в 1 мл субстрата.
Реактивы и материалы. Ацетон. Хлорид натрия (pH 7,1 - 7,2), 0,85-процентный раствор. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Мертиолят. Меченная изотиоционатом флюоресцеина ослиная сыворотка против глобулинов кролика (изготовленная в Институте эпидемиологии и микробиологии им. И.Ф. Гамалеи). Специфическая антигранулезная кроличья сыворотка. Адъювант Фрейнда.
Приборы, аппаратура, посуда. Люминесцентный микроскоп. Окулярная сетка. Объект-микрометр. Центрифуга (до 12 тыс. об./мин.). Термостат (37 °C). pH-Метр. Колбы. Пробирки бактериологические. Чашки Петри. Предметные стекла. Пипетки мерные и пастеровские.
Способ приготовления иммунных сывороток в лабораторных
условиях. В качестве инъекционного материала используют суспензию
9
очищенных гранул в растворе NaCl с титром не менее 1 x 10 грн/мл.
Гранулы извлекают из препарата вирин-ГЯП следующим образом.
Препарат диспергируют на магнитной мешалке в течение 20 мин. Затем
проводят дифференциальное центрифугирование при 1,5 тыс. об./мин.
для осаждения крупных частиц тканей гусениц 15 мин. Супернатант
отсасывают пипеткой, размешивают на магнитной мешалке и
центрифугируют при 2,5 тыс. об./мин. для осаждения микроорганизмов
10 мин. Осаждают гранулы центрифугированием при 12 тыс. об./мин. в
течение 1 ч. Осадок гранул ресуспендируют в физиологическом
растворе и полученную суспензию обрабатывают антибиотиками из
расчета 500 - 1000 ед. пенициллина и стрептомицина на 1 мл взвеси.
Перед инъекцией взвесь гранул отмывают от антибиотиков центрифугированием при 12 тыс. об./мин. и ресуспендируют в стерильном 0,85-процентном растворе NaCl.
Одна из возможных схем иммунизации следующая: 3-кратное с интервалом в 3 дня подкожное обкалывание. При первой инъекции вводится 2 мл смеси антигена с адъювантом (1:1), при второй - 4 мл, при третьей - 6 мл смеси. Реиммунизация через 2 недели. Одна инъекция 6 мл смеси подкожно. Забор крови через неделю после реиммунизации. Сыворотку надо хранить с консервантом (мертиолят 1:10000) при температуре 20 °C либо лиофилизировать.
При отсутствии адъюванта и ограниченном количестве вируса можно рекомендовать следующий способ иммунизации: 2-кратное субконъюнктивальное введение с недельным интервалом. Реиммунизация через месяц. При каждой инъекции вводят по 0,5 мл суспензии гранул под конъюнктиву каждого глаза.
Подготовка к определению. Накануне исследования следует отъюстировать микроскоп, установить фильтры. Для подсчета гранул по форме, приводимой ниже, необходимо с помощью объект-микрометра определить сторону квадрата окулярной сетки, затем и ее площадь (S). При отсутствии окулярной сетки определяют с помощью объект-микрометра диаметр поля зрения и вычисляют площадь его по формуле:
2
S = пи r .
Отбор проб. Пробы с растительных объектов (листья, плоды) отбирают в стерильные бумажные пакеты.
Площадь поверхности плодов (яблок) определяют по формуле:
2
S = пи r .
Площадь поверхности листьев определяют следующим образом. Обводят на бумаге контур листа. По крайним точкам контура строят прямоугольник и измеряют его площадь. Затем определяют массу прямоугольника и массу вырезанного контура листа. Из полученной пропорции вычисляют площадь листа.
Из листьев делают нарезки и помещают их в колбу с подщелоченным 0,85-процентным раствором NaCl в соотношении 1:10. Колбу энергично встряхивают 10 - 15 мин., отстаивают 10 мин., надосадок центрифугируют 1 ч при 12000 об./мин., ресуспендируют в 1 мл воды.
Пробы с плодов можно брать методом смыва. Для этого пинцетом берут салфетку 5 x 5 см, смазывают в 0,85-процентном растворе NaCl (pH 7,4 - 7,6), избыток отжимают и тщательно протирают исследуемую площадь. Затем салфетку переносят в колбу с раствором NaCl (100 мл), энергично встряхивают 3 - 5 мин., салфетку отжимают пинцетом и удаляют. Полученные смывы фильтруют через 3 слоя марли для удаления грубых частиц, затем центрифугируют при 5 тыс. об./мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл дистиллированной воды.
Ход анализа. Аликвоту исследуемой суспензии 0,02 мл наносят на заранее размеченное предметное стекло площадью 4 кв. см. Высушивают на воздухе и фиксируют в ацетоне 10 мин. Для гашения неспецифического свечения препарат обрабатывают синькой Эванса, для чего используют ее водный раствор в разведении 1:10000. Время обработки не менее 10 мин. Препарат промывают в проточной воде, высушивают на воздухе. Препарат должен иметь слабо-голубую окраску. Затем на препарат наносят иммунную сыворотку против гранул яблонной плодожорки, предварительно разведенную 1:10 0,85-процентным раствором NaCl. Помещают в термостат во влажной камере (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне) при 37 °C. Через 20 мин. сыворотку смывают проточной водой, препарат подсушивают на воздухе, после чего наносят ослиную антикроличью меченную ФИТЦ сыворотку в рабочем разведении, указанном на ампуле. Выдерживают в термостате 20 мин. с последующим промыванием в проточной воде.
Подсушенный препарат готов к просмотру, который можно проводить в любом люминесцентном микроскопе, а также в обычном световом с применением опак-иллюминатора и люминесцентной установки ОИ-17, ОИ-18. Изложенный метод окраски позволяет выяснить даже единичные гранулы по их специфическому свечению. Ободок гранул имеет ярко-зеленое свечение на общем темном фоне препарата.
Контролем служат: препараты, приготовленные по той же схеме, но без обработки специфической сывороткипрепараты, приготовленные из проб, взятых на необработанных участках.
Обработка результатов анализа. Число гранул на 1 кв. см исследуемой поверхности (M), определяют по формуле:
aSn
M = -----,
S VS
1 п
где:
a - среднее число гранул в одном квадрате окулярной сетки;
S - площадь мазка, кв. мм;
S - площадь квадрата окулярной сетки (площадь поля зрения),
1
кв. мм;
V - объем нанесенной на стекло суспензии, мл;
S - площадь исследуемой поверхности, кв. см;
п
n - разведение.
Гранулы подсчитывают не менее чем в 50 квадратах окулярной
сетки.
Пример. Для анализа взяли лист с обработанного препаратом
дерева. Определили площадь его поверхности: S = 70 кв. см x 2 =
п
140 кв. см (70 кв. см - площадь одной стороны листа). Сделали смыв
с листа и обработали описанным способом. Полученный препарат
покрасили. При просмотре препарата из смыва в люминесцентном
микроскопе подсчитали общее количество гранул в 50 квадратах
окулярной сетки (SUM = 335). Отсюда
50
SUM
50 335
a = ----- = --- = 6,7.
50 50
Площадь мазка S = 20 мм x 20 мм = 400 кв. мм. Площадь квадрата окулярной сетки определили с помощью объект-микрометра (S = 0,01 кв. мм). Объем нанесенной на стекло суспензии V = 0,02 мл. Разведение n = 1, т.к. полученный осадок гранул из смыва ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды.
6,7 x 400 4
M = ----------------- = 9,8 x 10 гранул на 1 кв. см.
0,01 x 0,02 x 140
Требования безопасности. При работе по определению остаточных количеств препарата вирин-ГЯП на растительных объектах соблюдаются общепринятые санитарно-гигиенические правила, рекомендуемые для работы с микроорганизмами IV группы (условно-патогенные).
Остальные материалы раздела: Указы СССР 1917-1992
Предыдущая Методические указания по определению бацитрацина в воздухе рабочей зоны методом бумажной хроматографии утв. Минздравом СССР 30.03.1981 N 2351-81Следующая Методические указания по определению бета-экзотоксина в препаратах битоксибациллина утв. Минздравом СССР 30.03.1981 N 2353-81