Утверждены
Минздравом СССР
20 марта 1986 г. N 4082-86
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ
АФЛАТОКСИНОВ В ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИКА
ОПРЕДЕЛЕНИЯ АФЛАТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Оборудование и материалы
1. Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78.
2. Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76 (завод "Химлаборприбор").
3. Кофемолка ЭКМ-ЗУ.
4. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41.
5. Жидкостный хроматограф высокой эффективности "Altex"модель 336 или другой хроматограф с аналогичными параметрами; колонка и предколонка с силикагелем типа "Ultrasphere Sf", с размером частиц 5 микрон; длина колонки 25 см, предколонки 4,5 см, внутренний диаметр колонок 0,46 см; флуоресцентный детектор "Kratos"модель FS-970 с кюветой, заполненной силикагелем, или другой детектор с аналогичными параметрами; ультрафиолетовый детектор "Kratos".
6. Микрошприц на 25 мкл.
7. Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками, например, стеклянные четырехугольные сосуды 195 x 195 x 200 мм завода "Дружная горка".
8. Пластины для ТСХ "Силуфол" размером 15 x 15 или 20 x 20 см, ЧССР.
9. Воронки делительные ВД2-250 или ВД2-500 по ГОСТ 8613-75.
10. Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 100 - 250 микрон (силикагель ЧССР).
11. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 ГОСТ 1770-74.
12. Цилиндры мерные на 250 мл с притертой пробкой, тип 2-250 по ГОСТ 1770-74.
13. Колбы плоскодонные конические на 250 и 500 мл с НШ 29 тип КнКШ 250-29/32 и 500-29/32 по ГОСТ 10394-72.
14. Колбы круглодонные на 1000 мл с НШ 29, тип ККШ-250-29/32 по ГОСТ 10395-72.
15. Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-72.
16. Воронки химические диаметром 150 мл по ГОСТ 8613-75.
17. Колонка стеклянная хроматографическая 2300 x 15 мм.
18. Распылитель стеклянный с грушей.
19. Афлатоксин B или смесь афлатоксинов B , B , G , G .
1 1 2 1 2
20. Афлатоксин M .
1
21. Ацетон по ГОСТ 2603-71.
22. Гексан по ТУ 6-09-3375-73.
23. Бензол по ГОСТ 5955-75.
24. Ацетонитрил по ТУ 6-09-3543-74.
25. Метанол по ГОСТ 6995-77.
26. Хлороформ медицинский или по ГОСТ 3160-51.
27. Эфир диэтиловый медицинский по ГОСТ 6265-52.
28. Вода дистиллированная.
29. Кислота лимонная по ГОСТ 3652-29.
30. Кислота азотная концентрированная по ГОСТ 4461-67.
31. Сульфат натрия безводный по ГОСТ 4166-76.
32. Натрий хлористый по ГОСТ 4233-66.
33. Свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027-67.
34. Окись алюминия для колоночной хроматографии (нейтральный) 40/250 (ЧССР).
1. Определение афлатоксинов B , B , G , G
1 2 1 2
в пищевых продуктах
1.1. Экстракция
При отборе проб следует руководствоваться требованиями ГОСТ 12330-66 "Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе". Отобранную пробу измельчают в течение 1 - 2 минут в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 25 г измельченного продукта помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, тщательно перемешивают с 25 мл 10-процентного раствора хлорида натрия. Добавляют 100 мл ацетона и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбирают 50 мл фильтрата.
1.2. Очистка экстракта
К 50 мл фильтрата добавляют 20 мл 15-процентного раствора ацетата свинца и 30 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют стоять на 10 минут в темноте. Отфильтровывают образовавшийся осадок через бумажный складчатый фильтр, отбирают 80 мл фильтрата. Обезжиривают в делительной воронке гексаном (2 x 30 мл), затем переэкстрагируют в хлороформ (1-ый раз 30 мл хлороформа, 2-ой раз смесью хлороформ-ацетон, 3:1 - 45 мл). Объединенные хлороформные экстракты помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, добавляют 5 - 7 г безводного сульфата натрия, встряхивают и оставляют стоять на 30 минут в темноте. Раствор фильтруют через кусочек ваты, помещенный в химическую воронку, в грушевидную колбу. Хлороформный раствор упаривают на ротационном испарителе до объема 1 мл. Далее производят очистку экстракта с помощью колоночной хроматографии.
На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, затем безводный сульфат натрия (толщина слоя 5 мм), наливают суспензию 2 г силикагеля в хлороформе, сверху насыпают слой безводного сульфата натрия (20 мм). Дают хлороформу стечь, затем на колонку наносят хлороформный экстракт образца, элюируют смесью хлороформ-ацетон (9:1) 60 мл. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе, остаток растворяют в 2 мл хлороформа, фильтруют через бумажный или капроновый фильтр в пробирку емкостью 5 мл, отдувают растворитель в токе азота, остаток растворяют в 400 мкл хлороформа (раствор А) и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
1.3. Приготовление стандартных растворов афлатоксинов
B , B , G , G
1 2 1 2
Стандартные растворы готовят следующим образом: навески
кристаллических афлатоксинов B , B , G , G в 1 мг помещают
1 2 1 2
в мерные колбы на 100 мл и доводят до метки смесью бензол-
ацетонитрил (98:2). Концентрации афлатоксинов в приготовленных
стандартных растворах составляют 10 нг/мкл.
Для приготовления рабочего раствора смеси афлатоксинов B , B ,
1 2
G и G с концентрациями 0,5 нг/мкл, 0,25 нг/мкл, 0,2 нг/мкл и 0,1
1 2
нг/мкл соответственно в мерную колбу на 50 мл помещают 2,5 мл
стандартного раствора афлатоксина B ; 1,25 мл B ; 1,0 мл G и
1 2 1
0,5 мл G , затем доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил
2
(98:2).
Стандартный раствор хранится в холодильнике при температуре ниже 0 °C, срок годности стандартного раствора 1 год.
1.4. Обнаружение и количественное определение
афлатоксинов B , B , G , G с помощью ВЭЖХ
1 2 1 2
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - эфир-метанол-вода 95:4:1,
скорость потока подвижной фазы - 1 мл/мин. Рекомендуется
использовать перегнанный метанол и бидистиллированную воду. Эфир
перед использованием пропускают через колонку с оксидом алюминия.
Все растворители необходимо предварительно отфильтровать.
Флуоресцентный детектор устанавливается на длину волны
возбуждающего излучения 360 нм (или устанавливается
соответствующий фильтр на линии возбуждения при работе с
флуоресцентным детектором без монохроматора), на линии эмиссии
устанавливается эмиссионный фильтр с полосой пропускания от 418
нм. Входное напряжение самописца - 10 мВ, чувствительность
детектора устанавливается таким образом, чтобы 1 нг афлатоксина B
1
соответствовало отклонение пера на полную шкалу самописца при
уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы. Предел обнаружения при
таких условиях составляет около 0,1 нг афлатоксина B во вколе
1
(при флуоресцентном детектировании).
Для калибровки прибора по флуоресцентному детектору в инжектор
с помощью микрошприца вводится 1 мкл рабочего раствора для ВЭЖХ
(соответствует 0,5 нг афлатоксина B , 0,25 нг B , 0,2 нг G и 0,1
1 2 1
нг G ) и 2 мкл рабочего раствора (1 нг B , 0,5 нг B , 0,4 нг G
2 1 2 1
и 0,2 нг G ). Для каждого количества афлатоксинов определяют
2
высоту пика. В приведенных выше условиях время выхода растворителя
составляет 3,0 - 3,5 мин., время удерживания афлатоксинов: для
B 9,0 - 10,0 мин., для B 11,0 - 11,8 мин., для G 13,0 - 14,0
1 2 1
мин., для G 15,6 - 17,0 мин. в зависимости от небольших изменений
2
в составе подвижной фазы и времени уравновешивания колонки.
При высоких уровнях загрязнения пищевого продукта
афлатоксинами (свыше 10 мкг/кг по афлатоксину B ) рекомендуется
1
использовать также показания УФ-детектора. Калибровку прибора по
УФ-детектору проводят также, как в случае флуоресцентного
детектора, вводя в петлю инжектора 10, 15 и 20 мкл рабочего
раствора (соответствует 5; 7,5 и 10 нг афлатоксина B ; 2,5; 3,75 и
1
5 нг афлатоксина B ; 2, 3 и 4 нг G , 1; 1,5 и 2 нг G ). Предел
2 1 2
обнаружения по УФ-детектору составляет 1 нг по афлатоксину B .
1
В инжектор хроматографа вводится с помощью микрошприца 20 мкл
раствора А. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания
с афлатоксином B (B , G , G ) определяют его высоту (h). Расчет
1 2 1 2
концентрации афлатоксина проводят по формуле:
V x V x V x m x h
1 3 5 ст
C = ----------------------,
V x V x V x M x h
2 4 6 ст
где:
C - концентрация афлатоксинов в пищевом продукте в мкг/кг;
V - объем водно-ацетоновой смеси в мл (125 мл);
1
V - объем водно-ацетонового фильтрата, взятый для анализа
2
(50 мл);
V - объем водно-ацетонового фильтрата и раствора ацетата
3
свинца (100 мл);
V - объем фильтрата после очистки ацетатом свинца (80 мл);
4
V - объем очищенного раствора экстракта в хлороформе перед
5
ВЭЖХ (400 мкл);
V - объем раствора экстракта, вводимого в петлю инжектора
6
хроматографа (20 мкл);
m - количество нг афлатоксина в введенном объеме стандарта;
ст
h - высота пика стандарта афлатоксина в мм;
ст
h - высота пика афлатоксина в введенном объеме экстракта в мм;
М - навеска продукта, взятая в г.
При приведенных в скобках объемах и навесках формула
содержания афлатоксинов выражается следующим образом:
h
C = 2,5 x --- x m .
h ст
ст
Если пик афлатоксина выходит за пределы шкалы самописца,
анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно, уменьшая объем вводимого
раствора экстракта (V ) или разбавляя раствор экстракта
6
хлороформом (увеличивая объем V ). При необходимости подтверждения
5
проводят совместный ввод экстракта со стандартом афлатоксинов.
1.5. Подтверждение наличия афлатоксинов
с помощью двумерной ТСХ
Для подтверждения наличия афлатоксинов пластинку "Силуфол"
размечают тонкими карандашными линиями. В правом нижнем углу на
расстоянии 1,5 см от краев наносят 20 мкл раствора А, в правом
верхнем углу наносят 5 мкл рабочего раствора смеси афлатоксинов. В
левом нижнем углу на расстоянии 1, 2 и 3 см от левого края и 1,5
см от нижнего края пластинки наносят 2, 5 и 10 мкл рабочего
раствора смеси афлатоксинов. Пластинку помещают в камеру для ТСХ
со смесью эфир-метанол-вода (94:4,5:1,5) и развивают пластинку в
1-ом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой
карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки.
Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 минут, затем развитие
пластинки проводят во втором направлении в системе
хлороформ-ацетон-вода (90:10:1). После достижения фронтом
растворителя тонкой карандашной линии ее извлекают из камеры и
сушат на воздухе. Рассматривают пластинку в длинноволновом
УФ-свете. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по
хроматографической подвижности и цвету флуоресценции пятнам
стандартов афлатоксинов, свидетельствует о возможном присутствии
афлатоксинов в пищевом продукте. Для подтверждения наличия
афлатоксинов ТСХ-пластинку опрыскивают раствором азотной кислоты в
воде (1:2) и рассматривают ее в длинноволновом УФ-свете. Если цвет
флуоресценции стандартов афлатоксинов изменился с синего (B , B )
1 2
или сине-зеленого (G , G ) на желтый цвет, а цвет флуоресценции
1 2
пятен экстракта на желтый не изменился, то афлатоксины в пробе
отсутствуют. Если же цвет флуоресценции пятен экстракта также
изменился на желтый, то это служит подтверждением возможного
наличия афлатоксинов в пищевом продукте.
2. Определение афлатоксинов B , B , G и G в маслах
1 2 1 2
2.1. Экстракция
К 15 г масла добавляют 25 мл гексана, 5 мл 4-процентного раствора хлорида натрия и 100 мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 40 - 50 минут. Затем смесь помещают в делительную воронку и отделяют нижний ацетонитрильный слой.
2.2. Очистка экстракта
Ацетонитрильный экстракт обезжиривают в делительной воронке гексаном (3 x 50 мл), высушивают сульфатом натрия и упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 мл хлороформа и проводят очистку с помощью колоночной хроматографии. На колонку с 4 г силикагеля (п. 1.2) наносят хлороформный экстракт, дают хлороформу стечь и промывают 100 мл смеси гексан-бензол-эфир (1:1:2). Афлатоксины элюируют 100 мл смеси хлороформ-ацетон (9:1). Элюат упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 мл хлороформа, фильтруют через бумажный или капроновый фильтр, отдувают растворитель в токе азота, растворяют в 400 мкл хлороформа и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (п. 1.4).
Расчет концентрации афлатоксина проводят по формуле:
V x h x m
1 ст
C = ------------,
V x h x M
2 ст
где:
C - концентрация афлатоксина в масле;
V - объем очищенного раствора экстракта в хлороформе перед
1
ВЭЖХ (200 мкл);
V - объем раствора экстракта, вводимого в петлю инжектора
2
хроматографа (20 мкл);
m - количество нг афлатоксина во введенном объеме стандарта;
ст
h - высота пика стандарта афлатоксина в мм;
ст
h - высота пика афлатоксина во введенном объеме экстракта в
мм;
М - навеска продукта, взятая в г.
Подтверждение наличия афлатоксина с помощью двумерной ТСХ
проводят аналогично п. 1.5.
3. Определение афлатоксина M в молоке
1
3.1. Экстракция
В коническую колбу на 250 мл помещают 50 мл натурального
молока или раствор 5 г сухого молока в 50 мл воды, 10 мл водного
раствора 2 г хлорида натрия и 0,24 г лимонной кислоты, 120 мл
хлороформа (все составные части предварительно подогревают до
температуры 35 - 38°. Содержимое колбы встряхивают 2 - 3 минуты,
переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют 15 минут при
3000 - 4000 об./мин. Отделяют нижний хлороформный слой, высушивают
над 10 г безводного сульфата натрия, отфильтровывают, замеряют
объем фильтрата (V ) и упаривают до 5 мл.
2
Очистку проводят с помощью колоночной хроматографии. На дно
стеклянной колонки помещают кусочек ваты, затем безводный сульфат
натрия (толщина слоя 5 мм), заливают суспензию 2 г (2 мл)
силикагеля в гексане и сверху насыпают слой безводного сульфата
натрия. Дают гексану стечь так, чтобы над слоем сульфата натрия
осталось около 5 мл гексана. Вносят 5 мл анализируемого экстракта,
дают растворителю стечь и затем колонку последовательно промывают
25 мл смеси толуол-уксусная кислота (9,5:0,5), 25 мл гексана и 25
мл смеси эфир-гексан-ацетонитрил (5:3:1). Афлатоксин M элюируют с
1
колонки 60 мл смеси хлороформ-ацетон (4:1). Элюат упаривают
досуха, растворяют в 200 мкл хлороформа и анализируют с помощью
высокоэффективной хроматографии.
3.2. Приготовление стандартного раствора
афлатоксина M
1
Навеску кристаллического афлатоксина M в 1 мг помещают в
1
мерную на 100 мл колбу и доводят до метки смесью
бензол-ацетонитрил (9:1). Концентрация афлатоксина M в
1
приготовленном стандартном растворе составляет 10 нг/мкл. Для
приготовления стандартного раствора афлатоксина M с концентрацией
1
0,2 нг/мкл в мерную колбу на 50 мл помещают 1 мл стандартного
раствора афлатоксина M и доводят до метки смесью
1
бензол-ацетонитрил (9:1).
3.3. Обнаружение и количественное определение
афлатоксина M с помощью ВЭЖХ
1
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза эфир-метанол-вода (90:8:2),
остальные параметры как в п. 1.4. Чувствительность детектора
устанавливается таким образом, чтобы 0,6 - 0,8 нг афлатоксина M
1
соответствовало отклонение пера на полную шкалу самописца при
уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы. Для калибровки
флуоресцентного детектора в инжектор вводится 1, 2, 3 мкл рабочего
афлатоксина M , что соответствует 0,2; 0,4; 0,6 нг афлатоксина M .
1 1
Для каждого количества афлатоксинов определяют высоту пика. В
приведенных выше условиях ВЭЖХ время удерживания афлатоксина M
1
8 - 9 минут.
В инжектор хроматографа вводится с помощью микрошприца 20 мкл
раствора очищенного экстракта. При наличии пика, совпадающего по
времени выхода с афлатоксином M определяют его высоту (h). Расчет
1
концентрации афлатоксина M проводят по формуле:
1
V x V x h x m
1 3 ст
C = -----------------,
V x V x h x M
2 4 ст
где:
C - концентрация афлатоксина M в молоке, мкг/кг;
1
V - объем хлороформа, взятого для экстракции (120 мл);
1
V - объем хлороформного экстракта, взятого для анализа;
2
V - объем очищенного экстракта в хлороформе перед ВЭЖХ
3
(200 мкл);
V - объем раствора экстракта, вводимого в петлю инжектора
4
хроматографа (20 мкл);
m - количество нг афлатоксина M в введенном объеме
ст
стандарта;
h - высота пика стандарта афлатоксина в мм;
ст
h - высота пика афлатоксина в введенном объеме экстракта в мм;
М - навеска продукта, взятая в г.
Если пик афлатоксина M в образце выходит за пределы шкалы
1
самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно, уменьшая объем
вводимого раствора экстракта (V ) или разбавляя раствор экстракта
4
хлороформом (увеличивая объем V ).
3
3.4. Подтверждение наличия афлатоксина M
1
с помощью двумерной ТСХ
Очистка и обнаружение афлатоксина M
1
ТСХ-очистку и обнаружение афлатоксина M проводят с помощью
1
двумерной ТСХ на пластинках "Силуфол" аналогично п. 1.5. В
качестве растворителей для развития хроматограмм используют в
первом направлении смесь эфир-метанол-вода (90:8:2), во втором
направлении смесь хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт (85:10:5).
Тесты, подтверждающие наличие афлатоксина M в продукте
1
Тесты, подтверждающие наличие афлатоксина M в продукте,
1
проводят аналогично п. 1.5.