Утверждены
Министерством здравоохранения СССР
29 июля 1991 г. N 6215-91
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЭФАЛЯ В БИОСУБСТРАТАХ
МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
(Дополнение к Методическим указаниям N 6132-91)
Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.
Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.
1. Краткая характеристика препарата
Эфаль - смесевой препарат:
(1) трис-O-(этилортофосфит)алюминия (аналог альетта):
O
││ C H AlO P .
(C H O-PO-) Al. 6 18 9 3
2 5 │ 3
H М.м. 354,0.
(2) фосфит алюминия:
AlPO . М.м. 106,0.
3
(3) фосфористая кислота:
H PO . М.м. 82,02.
3 3
Эфаль - 66,6% к.э. - вязкая прозрачная жидкость, хорошо растворимая в воде. Компоненты препарата I, III в воде растворимы, II - труднорастворимы; в органических растворителях практически не растворимы.
МДУ эфаля в огурцах - 0,5 мг/кг, винограде - 0,8 мг/кг, в воде - 0,3 мг/л.
2. Методика определения эфаля в биосубстратах
методом газожидкостной хроматографии
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Метод основан на извлечении эфаля из исследуемого объекта водой, концентрировании и последующем определении методом реакционной газожидкостной хроматографии в виде метилпроизводных.
2.1.2. Метрологическая характеристика метода
Минимально детектируемое количество в хроматографируемом объеме:
этилфосфита алюминия 0,1 нг;
фосфористой кислоты 0,1 нг.
Среднее значение определения в различных органах и тканях (селезенка, почки, сердце, мозг, сальник, печень <*>) при n = 10, %, - 79.
--------------------------------
<*> Печень составляет исключение, полнота извлечения из печени не превышала 15% от заданного количества. Будут проведены дополнительные исследования.
Размах варьирования (селезенка, почки, сердце, мозг, сальник), %, - 63 - 90.
Стандартное отклонение +/- 12,7%.
Доверительный интервал среднего при P = 0,95; n = 10 - 9,1%.
2.1.3. Избирательность метода
Условия экстракции и последующего газохроматографического определения эфаля (этилфосфита алюминия и фосфористой кислоты) позволяют избирательно определять препарат в присутствии фосфорорганических и пестицидов других групп.
2.2. Реактивы и материалы
Ацетонитрил, ч, ТУ 6-09-3534-87.
Метилгликоль (метилцеллозоль), чда, МРТУ 6-09-6347-69.
Гидразингидрат, чда.
Кали едкое, ч, ГОСТ 24363-80.
Хлороформ, хч, ГОСТ 20015-74.
Кислота уксусная (ледяная), хч, ГОСТ 18270-81.
Кислота серная, хч, ГОСТ 4204-77, 20-процентный раствор.
Метиловый спирт, хч, ГОСТ 6995-77.
Диэтиловой эфир, хч, ГОСТ 6262-79.
Азот в баллоне, особой чистоты, ГОСТ 9293-74.
Водород в баллоне, ГОСТ 3022-88.
Неподвижная фаза 15% Карбовакс 20 М на хроматоне N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм).
Этилфосфит алюминия, хч.
Фосфористая кислота, хч.
Основные стандартные растворы (ОСР) этилфосфита алюминия и фосфористой кислоты с концентрацией по 100 мкг/мл готовят взятием навески каждого вещества 10 мг (0,0100 г) хч и растворением в дистиллированной воде в мерных колбах емкостью 100 мл. Хранить в холодильнике не более 10 дней.
Рабочие стандартные растворы с содержанием 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2 мкг/мл готовят разбавлением ОСР водой. Хранить не более 2 дней.
2.3. Приборы, аппаратура и посуда
Газовый хроматограф серии "Цвет" или аналогичный с пламенно-фотометрическим (фосфорным) детектором (ПФД).
Колонка стеклянная, длина 2 м, диаметр 3,5 мм.
Микроизмельчитель тканей, тип РТ-2, ТУ 64-1-1305-79.
Ротационный испаритель типа ИР-1М, ТУ 25-11-917-76.
Колбы грушевидные (круглодонные), ГОСТ 25336-82, вместимостью 500 мл, 100 мл, 50 мл ОКШ 500-29/50-14.
Колбы мерные на шлифах, ГОСТ 1770-74, вместимостью 5 мл.
Пипетки, ГОСТ 20292-74, на 0,1; 0,2; 15; 10 мл.
Микрошприц на 10 мкл МШ-10, ТУ SE-2.833-024.
Прибор для получения диазометана (рис. 1 - не приводится):
- колба круглодонная трехгорлая, емкостью 500 мл на шлифах (реакционный сосуд);
- холодильник Либиха на шлифах;
- делительная воронка на шлифе (капельница);
- П-образный переходник на шлифах;
- капилляр.
2.4. Подготовка к определению
2.4.1. Подготовка колонки для ГЖХ
Колонку заполняют стандартной фазой (15% Карбовакс 20 М на Хроматоне N-AW-DMCS), подключив ее к вакууму водоструйного насоса. Заполненную колонку кондиционируют в термостате колонок в течение 6 часов без подключения к детектору, продувая азотом (20 - 24 мл/мин.) и постепенно поднимая температуру от 100° до 150°. Затем колонку присоединяют к детектору.
2.5. Описание определения
2.5.1. Экстракция
2 г образца гомогенизируют в микроизмельчителе тканей с 30 мл
дистиллированной воды, дают отстояться и отфильтровывают водную
фазу через складчатый фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют
2 x 10 мл воды. Объединенные водные экстракты переносят в колбу
для отгонки и конденсируют до ~ 2 мл под вакуумом водоструйного
насоса при температуре бани не более 45 °C. Измеряют точно объем
сконцентрированной пробы (V ), отбирают 0,2 мл, переносят в мерную
1
пробирку и доводят до 2 мл смесью растворителей
метилгликоль - ацетонитрил (1:1). Полученную смесь переносят в
центрифужную пробирку и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение
15 минут, после чего отбирают для дальнейшего метилирования 1 мл
центрифугата; либо фильтруют через небольшой бумажный фильтр
"красная лента" и также отбирают для метилирования точно 1 мл
смеси, что соответствует аликвоте 0,1 мл (V ) сконцентрированного
2
(V ) экстракта.
1
2.5.2. Получение метилпроизводных эфаля (этилфосфита алюминия
и фосфористой кислоты)
Подготовленные аликвоты экстрактов (V ) метилируют
2
диазометаном. Одновременно метилируют стандартные растворы
этилфосфита алюминия и фосфористой кислоты. Для этого берут 0,1 мл
рабочих стандартных растворов (10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2 мкг/мл) и по
0,9 мл смеси растворителей метилгликоль - ацетонитрил (1:1), т.е.
подготовленные к метилированию и дальнейшему
газохроматографическому анализу стандарты содержат 1 мкг/мл, 0,5
мкг/мл, 0,2 мкг/мл этилфосфита алюминия или фосфористой кислоты.
2.5.2.1. Получение диазометана
Вследствие токсичности и раздражающего действия диазометана прибор должен быть установлен в вытяжном шкафу. При работе использовать индивидуальные средства защиты: экран, перчатки, очки.
В реакционную колбу (см. рис. 1) помещают 6 г кали едкого, 3 мл метанола и 3 мл гидразингидрата. Через смесь продувают азот с расходом 100 мл/мин. Из капельницы подают хлороформ со скоростью 1 капля за 1 - 2 с.
2.5.2.2. В подготовленные пробы и стандарты вводят по 5 - 6 мкл ледяной уксусной и 3 - 5 мкл 20-процентной серной кислоты и продувают получаемый в описанном выше приборе диазометан до появления интенсивной желтой окраски раствора пробы или стандарта. Затем немедленно нейтрализуют избыток диазометана в пробе (стандарте) прибавлением нескольких микролитров уксусной кислоты до исчезновения окраски. Пробы и стандарты готовы к газохроматографическому определению.
После окончания метилирования прекращают подачу в реакционную колбу хлороформа, отключают азот, остатки в реакционной колбе заливают водой и тщательно промывают колбу и все части прибора водой.
2.5.3. Хроматографический анализ
Газовый хроматограф серии "Цвет" с пламенно-фотометрическим (фосфорным) детектором (ПФД).
Колонка хроматографическая стеклянная длиной 2 м, внутренним диаметром 3,5 мм.
Неподвижная фаза 15% Карбовакс 20 М на хроматоне N-AW-DMCS.
Температура колонки 145 °C.
Температура испарителя 180 °C.
Газ-носитель - азот с расходом 50 мл/мин.
Расход водорода 65 мл/мин.
Вводимый объем 1 - 3 мкл.
-9
Шкала множителя 2 x 64 x 10 .
Скорость диаграммной ленты 240 мм/час.
Время удерживания:
диметилфосфоната (метилирование фосфористой кислоты): 2,1 мин;
метилэтилфосфоната (метилирование этилфосфита алюминия): 2,6 мин.
Пределы определения:
диметилфосфоната - 0,1 нг;
метилэтилфосфоната - 0,1 нг.
Количественную оценку проводят методом соотношения со стандартом этилфосфита алюминия и фосфористой кислоты.
Расчет результатов анализа проводят по формуле:
C x H x V x V
2 3 1
X = ----------------,
H x V x V x P
1 2 4
где:
X - содержание этилфосфита алюминия (фосфористой кислоты) в
анализируемой пробе, мг/кг;
C - концентрация стандартного раствора для ГЖХ, вводимого в
хроматограф, мкг/мл;
H - высота пика стандартного раствора, мм;
1
H - высота пика пробы, мм;
2
V - конечный объем сконцентрированного экстракта пробы, мл;
1
V - часть экстракта V , взятая для метилирования, мл;
2 1
V - объем стандартного раствора, введенного в хроматограф,
3
мкл;
V - объем пробы, введенной в хроматограф;
4
P - масса анализируемой пробы, г.
3. Техника безопасности
Соблюдать все необходимые требования безопасности при работе в химических лабораториях, а также Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях, отделениях, отделах санитарно-эпидемиологических учреждений системы МЗ СССР, N 2455-81 от 20.10.81.
Особое внимание обратить при работе с гидразингидратом и диазометаном. Соблюдать требования безопасности, описанные в методике. Гидразингидрат - токсичная, пожароопасная жидкость (температура воспламенения 59°, самовоспламенения 267°). При попадании гидразингидрата на окружающие предметы, руки, одежду его немедленно смывают большим количеством воды.