Утверждены
Минздравом СССР
11 июля 1988 г. N 4676-88
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГИББЕРСИБА В ЛУКЕ, ЧЕСНОКЕ, КАРТОФЕЛЕ,
ОГУРЦАХ, КАБАЧКАХ, БАКЛАЖАНАХ, КАПУСТЕ, ГОРОХЕ, ФАСОЛИ,
ВИНОГРАДЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
--------------------------------
<*> Разработаны Е.Ю. Козловой, С.М. Обут (НИОХ СО АН СССР).
Краткая характеристика препарата. Натриевая соль гибберелловой кислоты
(гиббереллин A ) - основное действующее начало препарата гибберсиб.
3
Молекулярная масса 368. Брутто формула C H O Na. Гибберсиб представляет
19 21 6
собой гигроскопический порошок от желтого до коричневого цвета, получаемый
высушиванием на распылительной сушилке продуктов метаболизма гриба Fusarium
moniliforme. Гибберсиб является смесью натриевых солей гиббереллинов,
карбоновых кислот и карбоната натрия. Растворимость гибберсиба в воде 2 г/л
при 20 °C. Растворим в этиловом и метиловом спиртах, этилацетате, ацетоне.
Нерастворим в бензоле и гексане. Гибберсиб применяют в качестве стимулятора
роста растений.
Принцип метода. Определение основано на экстракции гиббереллинов из растительной массы этилацетатом с последующей тонкослойной хроматографией экстракта, обнаружении компонентов путем обработки пластинок 70-процентной серной кислотой, элюировании гиббереллина с пластинок и спектрофотометрировании элюата в области 250 - 270 нм.
Метрологическая характеристика метода. Диапазон определяемых
концентраций 0,1 - 25 мг/кг. Предел обнаружения препарата на пластинках 10
мкг, предел определения в растительной продукции - 0,1 мг/кг. Среднее
значение определения стандартных количеств гиббереллина A 80%. Стандартное
3
отклонение +/- 11%. Доверительный интервал среднего значения (при p = 95 и
n = 5) +/- 13%.
Избирательность метода. Определению не мешают неорганические компоненты препарата, карбоновые кислоты, другие гиббереллины, экстрактивные вещества из плодов, а также хлор- и фосфорсодержащие пестициды.
Реактивы и растворы. Этилацетат ч. Хлороформ. Метанол ч.д.а. Спирт
этиловый. Кислота хлороводородная х.ч., 7-процентный водный раствор.
Сульфат магния ч., прокаленный. Аммиак водный технический, 0,5-процентный
водный раствор. Хлорид натрия х.ч., насыщенный водный раствор. Вода
дистиллированная. Серная кислота х.ч., 70-процентный водный раствор.
Гиббереллин кристаллический. Стандартный раствор гиббереллина
кристаллического (A ) - 120 мг в 100 мл этилацетата. Срок хранения 1 мес. в
3
холодильнике. Пластинки "Силуфол"размером 5 х 15, 15 х 15 или 20 х 20 см.
Приборы и посуда. Спектрофотометр СФ-16, СФ-26. Комплект для
тонкослойной хроматографии типа АТХ-1. Центрифуга типа ЦЛС-31М. Ротационный
вакуумный испаритель. Мясорубка бытовая или измельчитель тканей типа РТ-2.
Весы аналитические. pH-метр. Пульверизатор стеклянный. Микропипетки или
микрошприц. Цилиндры мерные. Воронки. Колбы. Шаблон для расчерчивания
пластинок на клиновидные полосы из оргстекла (рис. 4 - не приводится).
Подготовка к определению. Построение градуировочного графика.
Стандартные количества гиббереллина A хроматографируют методом клиновидной
3
хроматографии, фотометрируют в условиях, описанных в разделе "Условия
хроматографирования", строят график зависимости оптической плотности от
содержания гиббереллина (табл. 64). Анализ начинают в день отбора проб или
на следующий день.
Таблица 64
ШКАЛА СТАНДАРТОВ ДЛЯ ПОСТРОЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОГО ГРАФИКА
┌─────────────────────────────────┬──────────────────────────────┐
│ Показатели │Номер градуировочного раствора│
│ ├──────┬─────┬─────┬─────┬─────┤
│ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │
├─────────────────────────────────┼──────┼─────┼─────┼─────┼─────┤
│Количество стандартного раствора,│0,05 │0,10 │0,20 │0,30 │0,40 │
│нанесенного на пластинку, мл │ │ │ │ │ │
│Содержание A , мг │0,060 │0,120│0,240│0,360│0,480│
│ 3 │ │ │ │ │ │
└─────────────────────────────────┴──────┴─────┴─────┴─────┴─────┘
Примечание. Концентрации стандартного раствора A 1200 мкг/мл, объем
3
раствора для элюирования с пластинок 5 мл.
Ход анализа. Экстракция. К 100 г измельченных на мясорубке плодов приливают 80 мл 0,5-процентного раствора аммиака, тщательно гомогенизируют встряхиванием и полученную массу осаждают на центрифуге в течение 5 - 7 мин. (4000 об./мин.). Надосадочную жидкость сливают, осадок промывают 30 мл раствора аммиака, снова осаждают, объединяют надосадочные жидкости и доводят pH 7-процентной соляной кислотой до 2,4 +/- 0,1. К этому раствору приливают 20 мл насыщенного раствора хлорида натрия и экстрагируют его в делительной воронке этилацетатом трижды порциями по 50 мл. Если при экстракции образуется коллоидный слой, его отделяют на центрифуге или разрушают коллоид этиловым спиртом, прибавляя последний в делительную воронку до растворения коллоидов, и отфильтровывают выпавшие при этом хлопья.
Этилацетатные экстракты объединяют, сушат над безводным сульфатом магния в течение 5 ч, отфильтровывают, выпаривают досуха с помощью ротационного вакуумного испарителя до постоянной массы с отсчетом до 0,0001 г. Затем сухой остаток растворяют в 3 мл этилацетата.
Условия хроматографирования. Стандартные пластинки "Силуфол" с помощью шаблона (см. рис. 4) расчерчивают на клиновидные полосы. Наносят на старт хроматограмм по 10 мкл проб (5 параллельных) и одну пробу стандартного раствора гиббереллина. Пластинки подсушивают на воздухе и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-метанол (8:2). Элюирование проводят дважды в одном направлении, каждый раз пропуская фронт растворителя до края пластинки.
По окончании элюирования пластинки подсушивают под тягой и опрыскивают 1,5 - 2 мл 70-процентной серной кислоты.
Рассматривают хроматограммы в УФ-свете при 254 нм, обводят
флуоресцирующие пятна, соответствующие гиббереллину A , вырезают их,
3
измельчают и заливают 5 мл этилацетата, оставляют стоять 20 мин.,
периодически взбалтывая. Затем осторожно сливают надосадочную жидкость и
измеряют ее спектр в области 250 - 270 нм (через 5 нм) в кювете с толщиной
поглощающего слоя 1 см против холостой пробы. Находят максимум поглощения и
определяют содержание гиббереллина A в анализируемой пробе по
3
градуировочному графику.
Обработка результатов анализа. Содержание гиббереллина A в плодах (X,
3
мг/кг) рассчитывают по формуле:
AM
X = --,
mP
где:
A - содержание гиббереллина A , найденное по градуировочному графику,
3
мг;
M - масса сухого экстракта, выделенного из навески плодов, мг;
m - количество сухого экстракта, нанесенного на пластинку, мг;
P - навеска плодов, взятая для экстракции, кг.
Требования безопасности. Выполняют правила безопасности, необходимые при работе в химической лаборатории.