Утверждены
Минздравом СССР
31 июля 1984 г. N 3061-84
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БОТРАНА В ПОЧВЕ, ВОДЕ, РАСТИТЕЛЬНОЙ
ПРОДУКЦИИ МЕТОДАМИ ТОНКОСЛОЙНОЙ И ГАЗОЖИДКОСТНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ <*>
--------------------------------
<*> Разработаны А.А. Красных, М.Ф. Зелениной, В.Ф. Логачевым, А.А. Меланьиной (ВНИИЗР).
Ботран - 2,6-дихлор-4-нитроанилин. Брутто-формула C H O N Cl .
6 4 2 2 2
Молекулярная масса 207,0. Общепринятое название - дихлоран. Химически
Чистое вещество ботрана - кристаллы желтого цвета с т. пл. 192 - 194 °C.
Ботран практически нерастворим в воде, растворим в большинстве органических
растворителей. Устойчив к гидролизу и окислению, не воспламеняется.
Выпускается в виде 75-процентного смачивающегося порошка. Ботран обладает
хорошим профилактическим действием против возбудителей болезней, вызываемых
грибами: ботридис, ризопус и склеротиния. ДСД 0,03 мг/кг.
Принцип метода. Метод основан на извлечении ботрана из исследуемой пробы органическим растворителем (ацетон, хлороформ), очистке экстракта путем перераспределения между двумя несмешивающимися жидкостями с последующим определением ТСХ или ГЖХ.
Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 48.
Таблица 48
МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БОТРАНА
┌──────────────────────────────────────────────┬─────────────────┐
│ Параметры │ Метод │
│ ├─────────┬───────┤
│ │ ТСХ │ ГЖХ │
├──────────────────────────────────────────────┼─────────┼───────┤
│Минимально детектируемое количество препарата │1 - 3 мкг│1 нг │
│Нижний предел определения, мг/кг: │ │ │
│ в воде │0,01 │0,005 │
│ в почве │0,02 │0,001 │
│ в растениях │0,08 │0,004 │
│Среднее значение определения (n = 15), %: │ │ │
│ в растениях │78,6 │82,5 │
│ в почве │88,0 │92,5 │
│ в воде │92,5 │92,5 │
│Стандартные отклонения, %: │ │ │
│ в растениях │+/- 9,0 │+/- 5,0│
│ в почве │+/- 8,7 │+/- 3,3│
│ в воде │+/- 7,8 │+/- 7,9│
│Доверительный интервал среднего │ │ │
│(p = 0,95 и n = 5), %: │ │ │
│ в растениях │+/- 5,6 │+/- 4,0│
│ в почве │+/- 8,7 │+/- 6,8│
│ в воде │+/- 4,5 │+/- 5,0│
└──────────────────────────────────────────────┴─────────┴───────┘
Избирательность метода. Метод специфичен в присутствии ароматических аминов растительного происхождения. Другие препараты, имеющие ароматическую аминогруппу (пирамин, азулокс и др.), в данных условиях хроматографирования определению не мешают.
Реактивы и растворы. Ацетон х.ч. н-Гексан х.ч. Хлороформ х.ч.
Ацетонитрил ч. Сульфат натрия безводный ч.д.а. Нитрит натрия х.ч.
Хлороводородная кислота х.ч. Этилацетат ч.д.а. Этанол х.ч. Пластинки
"Силуфол" УФ . Азот особой чистоты. Хроматон N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм)
254
с 5% SE-30. Хроматон N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм) с 5% XE-60. Проявляющий
реагент - 1-процентный раствор 1-нафтиламина в этаноле. Раствор хранят в
холодильнике не дольше 15 дней. Стандартный раствор ботрана (1 и 100 мкг в
1 мл ацетона) хранят в холодильнике не дольше 30 дней.
Приборы и посуда. Аппарат для встряхивания. Испаритель ротационный. Воронки: делительные на 250 млхимические. Хроматографическая камера. Камера для опрыскивания. Пульверизатор стеклянный. Колбы: конические нормального шлифа; остродонные; мерные на 100 мл. Микропипетки на 0,1 мл. Камера для диазотирования. Газовый хроматограф "Цвет-106" или другой марки с ДПР. Микрошприц на 10 мкл. Колонка хроматографическая стеклянная длиной 1 м с внутренним диаметром 3 мм. Баллоны газовые. Секундомер. Холодильник.
Ход анализа. Экстракция. Анализируемую пробу воды помещают в делительную воронку, препарат экстрагируют трижды хлороформом порциями по 40 мл в течение 5 мин. Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют на ротационном испарителе до объема 0,3 мл при температуре воды в бане не выше 50 °C. Остаток удаляют в токе воздуха.
Свежеотобранную пробу почвы (100 г) заливают 70 мл ацетона. Ботран экстрагируют, встряхивая в течение 1 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр со слоем безводного сульфата натрия, колбу и фильтр промывают тремя порциями того же растворителя по 10 мл. Объединенный экстракт отгоняют на ротационном испарителе до объема 0,2 - 0,3 мл. Остаток удаляют в токе воздуха.
Из 25 г измельченной пробы растительного материала (зеленая масса, капуста, морковь, лук-репка) ботран экстрагируют 50 мл хлороформа или этилацетата путем встряхивания в течение 1 ч. Измельченные клубни картофеля (25 г) заливают до покрытия поверхности хлороформом и оставляют на ночь, экстракты отфильтровывают, сушат над безводным сульфатом натрия и отгоняют до небольшого объема на ротационном испарителе. Остаток удаляют в токе воздуха.
Очистка экстракта. Сухой остаток из почвы и растительного материала растворяют в 5 мл ацетонитрила, добавляют 50 мл дистиллированной воды и отфильтровывают через плотный бумажный фильтр. Из водно-ацетонитрильного раствора ботран экстрагируют н-гексаном трижды порциями по 40 мл в течение 3 мин. Экстракт объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и отгоняют досуха на ротационном испарителе.
Условия определения методом ГЖХ. Хроматограф "Цвет-106" с ДПР. Сухой
остаток растворяют в точно известном количестве ацетона (5 - 10 мл). С
помощью микрошприца в испаритель хроматографа вводят аликвотную часть
исследуемого раствора (2 - 4 мкл). Используют стеклянную колонку длиной 1 м
с внутренним диаметром 3 мм, заполненную хроматоном N-AW-DMCS (0,16 - 0,20
мм) с 5% SE-30. Температура (°C): термостата колонки - 130, термостата
детектора - 190, испарителя - 240. Скорость тока азота (газа-носителя) 60
-12
мл/мин. Шкала электрометра 20 x 10 А. Скорость движения ленты самописца
200 мм/ч. Время удерживания 4 мин. 25 с.
Можно использовать альтернативную колонку длиной 1 м с внутренним
диаметром 3 мм, которую заполняют хроматоном N-AW-DMCS с 5% XE-60.
Температура (°C): термостата колонки - 150испарителя - 240; термостата
детектора - 210. Скорость тока азота 60 мл/мин. Шкала электрометра
-12
20 x 10 А. Скорость движения ленты самописца 200 мм/ч. Время
удерживания 6 мин. 30 с.
Условия определения методом ТСХ. Сухой остаток растворяют в 0,2 - 0,3 мл ацетона (хлороформа) и переносят на хроматографическую пластинку. Стенки колбы обмывают несколькими каплями того же растворителя, который переносят в центр пятна. Справа наносят стандартные растворы препарата. Пластинки помещают в камеру с системой растворителей гексан-ацетон в соотношении 5:1 по объему. После подъема фронта растворителей на высоту 10 см пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе и помещают на 20 мин. в камеру (эксикатор), насыщенную парами оксидов азота. Пары оксидов азота получают следующим образом: на дно помещают стаканчик с 1 - 2 г нитрита натрия, осторожно приливают 10 - 15 мл 20-процентной хлороводородной кислоты и закрывают крышкой.
Пластинку вынимают из камеры и обрабатывают 1-процентным раствором
альфа-нафтиламина в этаноле. Препарат проявляется в виде ярко-красных пятен
на светлом фоне с величиной R 0,45 - 0,47. Количественное определение
f
проводят путем сравнения интенсивности окраски и площади пятен проб и
стандартных растворов.
Обработка результатов анализа. Содержание препарата (X, мг/кг, мг/л)
при определении методом ГЖХ рассчитывают по формуле:
A H V
ст пр к
X = --------,
H V P
ст х
где:
A - количество препарата в стандартном растворе, нг;
ст
H - высота пика соответственно стандартного и анализируемого
пр
растворов, мм;
V - объем экстракта, введенного в хроматограф, мкл;
х
V - объем конечного экстракта, в котором растворен сухой остаток, мл;
к
P - масса или объем пробы, г, мл.
Содержание ботрана при определении методом ТСХ рассчитывают по формуле:
AS
2
X = ---,
PS
1
где:
A - содержание препарата в стандартном растворе, мкг;
S и S - площадь пятна соответственно стандартного раствора и пробы,
1 2
кв. мм;
P - масса или объем анализируемой пробы, г, мл.
Требования безопасности. Следует соблюдать все требования безопасности, обычно рекомендуемые для работы с органическими растворителями.