Утверждены
Минздравом СССР
8 июня 1987 г. N 4345
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БАЗАГРАНА В РЫБЕ
МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Краткая характеристика препарата дана в Методических указаниях. ДСД 0,002 мг/кг.
Принцип метода. Метод основан на извлечении базаграна из
измельченной мышечной ткани рыбы органическими растворителями,
очистке экстракта и хроматографировании в тонком слое пластинок
"Силуфол" УФ . Подвижной фазой служит смесь органических
254
растворителей. Проявление хроматограмм можно осуществить двумя
способами: 1 - термическое разложение базаграна, диазотирование
нитритом натрия в солянокислой среде, азосочетание солей
фенилдиазония с 1-нафтолом; 2 - активация базаграна УФ-светом,
хлорирование и взаимодействие с о-толидином.
Метрологическая характеристика метода. Минимально детектируемое количество 1 мкг. Нижний предел определения 0,05 мг/кг. Среднее значение определения 95%. Стандартное отклонение +/- 2,5%. Доверительный интервал среднего при p = 0,95 и n = 5 +/- 4,9%.
Избирательность метода. Определению базаграна не мешают арезин, диурон, линурон, монурон, пропанид, солан, фалоран, применяемые на зерновых культурах.
Реактивы и растворы. Ацетон х.ч. Бензол х.ч. Гексан ч.
Этиловый спирт 96-процентный. Перманганат калия. Хлороводородная
кислота х.ч. Сульфат натрия безводный. Пластинки "Силуфол" УФ
254
размером 150 x 150 мм. Силикагель АСК. о-Толидин ч. Хлороформ х.ч.
Этилацетат х.ч. Нитрит натрия х.ч. Диэтиловый эфир (для наркоза).
Фармакопея СССР. Стандартный раствор базаграна в ацетоне с
содержанием 100 мкг/мл. Проявляющие реагенты: N 1 (к смеси,
состоящей из 46 мл дистиллированной воды и 4 мл концентрированной
хлороводородной кислоты, прибавляют 1 г нитрита натрия); N 2 (в
50 мл дистиллированной воды растворяют 3 г едкого кали, прибавляют
0,5 г 1-нафтола); N 3 - насыщенный раствор о-толидина в
этилацетате. В холодильнике растворы хранятся продолжительное
время.
Приборы, посуда. Ротационный вакуумный испаритель. Водяная баня. Воронки: Бюхнера на 50, 100 мл; делительные на 100, 250, 500 мл. Камера для опрыскивания. Камера для хроматографирования. Колбы: мерные на 50, 100 млконические на 100, 250, 500 мл. Лампа ртутно-кварцевая ОКН-11. Микрошприц на 10 мкл. Пластинки стеклянные размером 15 x 15 или 20 x 20 см. Пипетки различной вместимости. Прибор для встряхивания. Цилиндры мерные на 10, 25, 50, 100, 250, 500 мл. Гомогенизатор или измельчитель тканей. Пульверизаторы стеклянные. Стеклянная хроматографическая колонка (диаметр x высота) 20 x 400 мм.
Подготовка к определению. Подготовка пластинок. Пластинки
"Силуфол" УФ активируют при температуре 130 - 140 °C 20 мин. в
254
сушильном шкафу. Подготовка хроматографических колонок для очистки
экстрактов от примесей. В нижнюю часть хроматографической колонки
размером 20 - 400 мм помещают 500 мг ваты, обезжиренной гексаном.
Затем засыпают в колонку силикагель АСК (70 мл) и уплотняют
силикагель постукиванием по колонке. Колонку промывают 50 мл
н-гексана или петролейного эфира и прошедший через нее
растворитель отбрасывают. После этого колонка готова для очистки
экстрактов из проб рыбы.
Ход анализа. Экстракция. Ткани подвергают деструкции, затем 20 г гомогената заливают в конической колбе с притертой пробкой диэтиловым эфиром (ацетоном, хлороформом или этилацетатом). Экстракцию базаграна проводят трижды в течение 1,5 ч при встряхивании порциями по 50 мл растворителя. Экстракты объединяют и фильтруют через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняют и испаряют на водяной бане при температуре 60 °C.
Сухой остаток растворяют в 10 мл ацетона и вносят его в колонку с силикагелем АСК. После впитывания экстракта в сорбент пестицид элюируют 110 мл смеси бензола с гексаном в соотношении 3:8 пропорциями по 25 - 30 мл. Через 10 мин. после впитывания последней порции растворителя сорбент отжимают с помощью груши. Элюат отгоняют или испаряют.
Хроматографирование. Сухой остаток после очистки экстрактов и
испарения растворителя растворяют 0,3 мл ацетона. В зависимости от
количества базаграна в пробе на пластинку наносят либо весь
раствор, либо аликвотную его часть. Пробу наносят на пластинку
"Силуфол" УФ с помощью шприца или пипетки в одну точку так,
254
чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Справа и слева от пробы на
расстоянии 2 см наносят стандартные растворы, содержащие близкие к
определяемому количества базаграна (2; 5; 10 мкг). Пластинку с
нанесенным раствором помещают в камеру для хроматографирования, на
дно которой за 30 мин. наливают подвижный растворитель: гексан -
ацетон (1:1), гексан - ацетон (1:3) или хлороформ - этиловый спирт
(9:1). После того как фронт растворителя поднимается на 10 см,
пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут для
испарения растворителя.
Для обнаружения базаграна на пластинках "Силуфол" можно использовать два альтернативных способа:
1. Пластинку помещают в сушильный шкаф, нагретый до 180 °C, и выдерживают 30 - 40 мин. Извлеченные из шкафа пластинки после охлаждения опрыскивают проявляющим реагентом N 1 и затем N 2. При наличии базаграна появляются пятна красного цвета.
2. После высушивания пластинки на воздухе ее облучают
УФ-светом 20 - 25 мин., затем помещают в камеру, насыщенную парами
хлора. Для получения паров хлора на дно эксикатора наливают
насыщенный водный раствор перманганата калия и такой же объем
концентрированной хлороводородной кислоты. Через 10 - 15 мин.
пластинку вынимают, оставляют на воздухе 15 мин. для удаления
избытка хлора и затем опрыскивают насыщенным раствором о-толидина
в этилацетате. Базагран обнаруживается в виде сиренево-фиолетовых
пятен на светлом фоне с R 0,52 в системе гексан - ацетон (1:1),
f
0,75 - в системе гексан - ацетон (1:3) и 0,57 - в системе
хлороформ - этиловый спирт (9:1).
Обработка результатов анализа. Количественно препарат определяют путем сравнения площади пятен. Измеряют площади с помощью миллиметровой бумаги. Пропорциональная зависимость между площадью пятна и концентрацией препарата наблюдается в интервале 1 - 10 мкг препарата.
Содержание базаграна в анализируемой пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:
AS
2
X = ---,
PS
1
где:
A - количество базаграна в стандартном растворе, мкг;
S , S - площади пятен соответственно стандартного раствора и
1 2
пробы, кв. мм;
P - масса исследуемой пробы, г.
Требования безопасности. Соблюдаются требования безопасности, обычно рекомендуемые для работы с органическими растворителями. При работе с кварцевой лампой необходимо пользоваться светозащитными очками.