Утверждаю
Заместитель Начальника
Главного управления
научно-исследовательских
институтов и координации
научных исследований
Н.А.ДЕМИДОВ
14 апреля 1977 года
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Методические рекомендации подготовлены Московским научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР.
Введение
Тактика лечения любого болезненного процесса зависит от знания его причин. В раскрытии этиологии кишечных заболеваний решающее значение имеют результаты бактериологического исследования. Особые трудности представляет расшифровка острых, и особенно длительно протекающих кишечных заболеваний, инфекционную природу которых нельзя доказать ни бактериологически, ни эпидемиологически. А тот факт, что в последние годы значительно ухудшились результаты антибиотикотерапии кишечных заболеваний, является одним из аргументов против инфекционной природы определенного числа кишечных расстройств.
Учитывая, что этиологически нерасшифрованные заболевания составляют 40 - 50% общей суммы кишечных расстройств, раскрытие их природы требует большого внимания микробиологов, инфекционистов, эпидемиологов. Становится очевидным, что проблема борьбы с кишечными заболеваниями требует новых подходов для понимания причин дисфункции кишечника при отсутствии выделения патогенных энтеробактерий - шигелл, сальмонелл.
К настоящему времени общепризнано, что при установлении природы кишечных расстройств нельзя игнорировать значение состава микрофлоры кишечника для его нормальной функциональной деятельности. Макроорганизм и населяющая его микрофлора, в том числе кишечника, являются сбалансированной экологической системой. Более того, в самом кишечном биоценозе существуют коррелятивные связи между отдельными родами, видами бактерий. Качественное или количественное изменение одного из компонентов биоценоза оказывает влияние на всю систему в целом. Нарушение же сложившегося в процессе эволюции биологического равновесия между микробной флорой и организмом не может быть для последнего безразличным. Поэтому при затяжных кишечных заболеваниях следует учесть, что они могут поддерживаться развившимся дисбактериозом кишечника. Это должно явиться основанием для определения в этих случаях качественного и количественного состава кишечной микрофлоры.
Накопленные наблюдения не только об отсутствии эффекта от этиотропной терапии (антибиотиками, химиопрепаратами) значительного числа острых, и особенно хронических, кишечных заболеваний, но об усугублении и более длительном течении болезненного процесса на фоне развившегося при этом дисбактериоза кишечника привели к тому, что в последние годы кишечные заболевания, связанные с дисбактериозом, получили самостоятельное место в клинике.
Установление роли дисбактериоза в патогенезе кишечных расстройств весьма важно и с эпидемиологических позиций. Кишечные заболевания, развившиеся на фоне дисбактериоза, не нуждаются в комплексе противоэпидемических мероприятий, применяемых при заболеваниях инфекционной природы.
Таким образом, показаниями к исследованию состояния кишечной бактериальной флоры являются:
1. Длительно протекающие кишечные расстройства, при которых не удается выделить патогенные энтеробактерии;
2. Затянувшийся период реконвалесценции после перенесенной острой дизентерии и других кишечных инфекций;
3. Дисфункция кишечника на фоне применения антибиотиков разными контингентами больных или длительного контакта с антибактериальными препаратами (на производстве антибиотиков, медперсонала и др.).
Первое издание методических материалов по бактериологической диагностике дисбактериоза кишечника 1969 года нашло применение как в научно-исследовательских, так и в практических диагностических лабораториях. Однако тираж первого издания не мог удовлетворить запросы специалистов. Кроме того, за прошедший период накоплены дополнительные материалы, которые вошли во второе издание.
1. МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА
Организм человека находится в постоянном взаимодействии с окружающей средой. Между тем из огромного числа микроорганизмов, непрерывно попадающих в пищеварительный тракт человека, только определенные роды, виды микробов нашли в кишечнике человека благоприятные условия существования; в процессе длительной эволюции они закрепились в кишечнике и составили его облигатную микрофлору, выполняющую важные для организма физиологические функции. Нельзя при этом не учесть, что отдельные факторы, такие как характер питания, сезон года, возраст, оказывают некоторое влияние на состав микрофлоры кишечника. С возрастом, например, происходит сдвиг в сторону увеличения грамположительной, гемолитической микрофлоры. Однако колебания, связанные с этими воздействиями, невелики, а способность здорового организма к саморегуляции обеспечивает быстрое восстановление относительного постоянства нормального биоценоза.
Из представителей облигатной микрофлоры кишечника прежде всего следует назвать бифидобактерии (Bifidobacterium) среди анаэробных микробов и кишечную палочку (Escherichia) - среди аэробных.
Основную микрофлору здоровых новорожденных детей, находящихся
на естественном вскармливании, составляют бифидобактерии, которые
-8 -11
обнаруживаются в больших разведениях фекалий (10 - 10 ).
Количество их составляет 85 - 95% числа всех микробов кишечника.
Число кишечных палочек в стуле у этих детей невелико. При переходе
на прикорм и более разнообразную пищу увеличивается количество
кишечной палочки, ацидофильных микробов, энтерококка. Вместе с
тем в противовес существовавшему ранее представлению о
преобладании анаэробных микробов только у детей, находящихся на
грудном вскармливании, установлено, что полного вытеснения
бифидобактерий не происходит, в норме они продолжают оставаться в
толстом кишечнике в значительных количествах в течение всей жизни
человека. Основные различия микрофлоры детей раннего возраста и
старших контингентов в разных количественных соотношениях
бифидобактерий и кишечной палочки.
У детей ясельного возраста аэробная кишечная микрофлора характеризуется еще более высоким содержанием кишечной палочки, энтерококка. У небольшого числа детей этого возраста выделяются лактозодефективные энтеробактерии и стафилококк. Среди аэробных энтеробактерий у здоровых детей, по данным Н.Д. Стерлиговой (1975), в фекалиях обнаруживаются кроме эшерихий и другие условно-патогенные бактерии семейства кишечных. Так, микробы рода Proteus выделяют 6 - 7% детей, каждый из родов Citrobacter, Enterobacter, Serratia - 1,0 - 1,4% здоровых детей. В анаэробной микрофлоре, как и у детей раннего возраста, преобладают бифидобактерии.
У здорового взрослого человека, не принимавшего до исследования антибиотиков и химиопрепаратов, основная аэробная микрофлора представлена на 90 - 95% полноценной в ферментативном отношении кишечной палочкой, которая разлагает в течение 18 - 20 часов лактозу и растет на среде Эндо в виде темно-красных колоний с металлическим блеском. Выделенные из этих колоний культуры расщепляют лактозу, глюкозу, маннит, мальтозу с образованием кислоты и газа; редко ферментируют сахарозу; образуют индол, сероводород, створаживают молоко, обладают активной подвижностью. Среднее количество кишечной палочки в 1 г фекалий составляет 300 - 400 млн. на средах Эндо и Левина и 800 млн. на 5% кровяном агаре.
У здоровых взрослых людей в 1,5% случаев обнаруживается кишечная палочка со сниженными ферментативными свойствами в первой генерации, которая растет на среде Эндо в виде бледно-розовых колоний. При последующем пересеве (вторая генерация) выделенная культура расщепляет лактозу до конца; количество ее в среднем составляет 21 млн./г фекалий. Гемолизирующие эшерихии, как правило, в фекалиях здоровых людей не обнаруживаются.
Лактозонегативные энтеробактерии обнаружены у 5,1% обследованных здоровых лиц (в среднем 24,9 млн./г). Последующая идентификация выделенных с первичного посева культур как из лактозонегативных, так и лактозоположительных колоний позволяет установить, что у взрослых людей среди представителей аэробной микрофлоры обнаруживаются различные роды условно-патогенных энтеробактерий, например, Citrobacter - у 3%, Enterobacter - у 1 - 1,5% и т.д. Однако определить количественное содержание каждого из указанных родов в 1 г фекалий не представляется возможным, так как подавляющее большинство этих родовых групп условно-патогенных энтеробактерий содержат варианты как ферментирующие, так и не ферментирующие лактозу; поэтому в первичном посеве трудно определить процентное содержание микробов каждого из этих родов энтеробактерий.
Энтерококк обнаружен у 20% взрослых людей при среднем количестве 634 млн./г. Энтерококк представляет собой диплококки удлиненной формы, более полиморфные, чем стрептококк и пневмококк; окрашивается положительно по Граму, неподвижен, желатин не разжижает, молоко не створаживает. Энтерококк в отличие от стрептококка дает в бульоне диффузный рост. От стрептококка его можно дифференцировать по ряду тестов: энтерококк разлагает маннит, растет на средах, содержащих 40% желчи, в молоке с 0,1% метиленовой сини редуцирует последнюю, устойчив к воздействию высокой температуры (до 60°).
Негемолизирующий и гемолизирующий стафилококк выделяют 2,2 - 1,5% взрослых людей, при этом средние числовые показатели негемолизующего стафилококка во много раз больше, чем гемолизирующего - 417 млн./г и 90 млн./г соответственно.
Грибы рода кандида почти, как правило, в посевах фекалий здоровых людей не обнаруживаются.
Молочнокислые микробы представляют сборную группу микроорганизмов, в которую входят ацидофильная и другие молочнокислые палочки, молочнокислые стрептококки, стрептобактерии. Они окрашиваются по Граму положительно, спор не образуют, неподвижны, молоко створаживают. Молочнокислые микробы требуют для культивирования сложных по составу питательных сред.
В анаэробной микрофлоре кишечника здорового человека
облигатными являются бифидобактерии. Они обнаружены у 92,7%
взрослых людей. Количественное содержание их значительно: в 96,1%
-11
проб они выделены из фекалий, разведенных до 10 , т.е. в 1 г
фекалий они составляют сотни миллиардов микробных тел.
Морфологически бифидобактерии имеют разветвления на концах
палочек, могут быть в форме римской цифры V или гантелей с
колбовидными утолщениями на концах, часто скопления их имеют вид
китайских иероглифов. Бифидобактерии окрашиваются по Граму
положительно (редко встречаются и грамотрицательные), образуют
кислоту без газообразования на средах с лактозой, глюкозой,
сахарозой; неподвижны, молоко не створаживают, индол и сероводород
не образуют, растут только в анаэробных условиях, спор не
образуют.
При посевах фекалий в анаэробных условиях вырастает также значительное количество бесспоровых грамотрицательных палочек, которые объединены в группу бактероидов. Палочки весьма полиморфны, могут иметь и кокковидную форму. Эта группа микробов очень мало изучена. В отношении их нет четкой классификации. О физиологической роли бактероидов для организма человека сведений достаточных нет. Слабая изученность этой группы бактерий объясняется трудностями культивирования - применения сложных питательных сред и условий строгого анаэробиоза.
Физиологическое значение нормобиоценоза велико и многообразно. Кишечная палочка, бифидобактерии характеризуются высокоантагонистическими свойствами, препятствующими развитию патогенных и ряда необычных для нормальной микрофлоры кишечника условно-патогенных микробов; тем самым барьерное действие нормальной микрофлоры кишечника можно рассматривать как один из факторов естественной резистентности организма. Известна также витаминообразующая функция нормальной микрофлоры кишечника - способность синтезировать ряд витаминов, особенно группы B. Нормальная микрофлора кишечника участвует в ферментативных процессах в толстом кишечнике, в частности в процессе расщепления кишечных ферментов - энтерокиназы и щелочной фосфатазы. Таким образом, нормальная кишечная микрофлора способствует поддержанию постоянства биохимической и биологической среды пищеварительного аппарата, обеспечивает его нормальное функционирование.
2. ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О ДИСБАКТЕРИОЗЕ КИШЕЧНИКА
Термином "дисбактериоз"кишечника определяют такие ассоциации микроорганизмов, которые качественно или количественно либо одновременно в том и другом направлении отличаются от нормального состава микрофлоры за счет исчезновения или снижения числа облигатных ее представителей, с одной стороны, увеличения числа энтеробактерий, отсутствующих или встречающихся в ничтожных количествах в норме, с другой. В итоге такие микробные ассоциации не в состоянии выполнить физиологические функции, осуществляемые нормальным биоценозом кишечника.
К настоящему времени уже известен ряд условий, при которых развивается дисбактериоз кишечника. Это прежде всего при кишечных инфекционных заболеваниях, в частности при дизентерии; при любых других заболеваниях, изменяющих реактивность организма. Клиническими наблюдениями и прямыми экспериментами на животных установлены нарушения нормальной микрофлоры также под влиянием антибиотиков, химиопрепаратов, лучевых воздействий.
Широкое распространение в последние годы дисбактериоза кишечника определяет его важное значение в клинике кишечных расстройств. А.Ф. Билибин трактует дисбактериоз как состояние срыва адаптации, ведущее к нарушению защитных и компенсаторных механизмов. Надо полагать, это имеет особенное значение в раннем детском возрасте при незрелости специфических и неспецифических факторов резистентности.
Что касается характеристики микробных ассоциаций при дисбактериозе кишечника, то таковые не однозначны. При одинаковой клинике могут быть разные микробные ассоциации, и наоборот. Однако можно полагать, что в любом случае снижение числа облигатной микрофлоры, обладающей высокой антагонистической активностью, создает условия для развития тех родов и видов энтеробактерий, размножение которых в нормальных условиях было подавлено конкуренцией активных симбионтов, либо тех микроорганизмов, которые оказались транзиторно в кишечнике. Чаще всего в этих условиях развиваются микробы, которые обладают высокой резистентностью к антибиотикам и менее требовательны к условиям размножения, а именно: гноеродные микробы, в первую очередь стафилококк, гнилостные (микробы рода протея и др.); грибы рода кандида.
У лиц с дисфункцией кишечника на фоне дисбактериоза в микробных ассоциациях могут присутствовать также условно-патогенные микробы семейства кишечных, которые не являются элементами облигатной микрофлоры, вместе с тем обнаруживаются и у здоровых людей. Так, при исследовании 1500 проб фекалий от детей с кишечными расстройствами (Стерлигова, 1975) микробы рода Hafnia были выделены в 10,9% проб, Aerobacter - в 4,2%, Citrobacter - в 3,9%, Klebsiella - в 0,9%, Arisona - в 0,9%, Serratia - в 0,5% проб против 6,6% - 1,4% - 1%, 1,4% - 0 - 1% соответственно у здоровых.
Важно при этом подчеркнуть, что при огромном числе накопленных наблюдений о характере микрофлоры при дисбактериозе не описано замещение нормальной микрофлоры одним каким-либо видом (родом) микробов. Как правило, дисбактериоз характеризуется тоже ассоциацией разных представителей энтеробактерий, но по составу отличной от нормобиоценоза. Более того, состав микрофлоры при дисбактериозе гораздо более пестрый и содержит до 5 и более родов, не характерных для нормальной микрофлоры. Широкие ассоциации условно-патогенных микробов часто сочетаются с более выраженной клиникой кишечного заболевания.
При вновь сложившихся ассоциациях имеющая место конкуренция в отношении питательного субстрата создает разные условия размножения, а следовательно, и разную численность популяций различных видов микроорганизмов. Снижение, например, кислотности среды в связи с подавлением молочнокислых бактерий создает благоприятные условия для размножения гнилостных бактерий: снижение числа антагонистов (в основном кишечной палочки, бифидобактерий) благоприятствует развитию кокковой микрофлоры и др.
Весьма важно, что между отдельными компонентами ассоциации при дисбактериозе не складываются, как при нормальном биоценозе, определенные стойкие взаимосвязи в отношении окислительно-восстановительного потенциала, взаимного использования продуктов обмена, витаминообразования, антагонистических взаимоотношений. Отсутствие закрепленных стойких условий взаимодействия внутри возникших ассоциаций подтверждается весьма быстрой сменой их состава. При повторных исследованиях даже через короткие промежутки времени характер микробных ассоциаций изменяется. Это является убедительным подтверждением того, что обнаруженный тот или иной вид (род) условно-патогенных микробов является не этиологическим фактором, а элементом дисбактериоза.
Качественные изменения состава микробного пейзажа в кишечнике при дисбактериозе выражаются в изменении ряда свойств кишечной палочки - основного симбионта аэробной микрофлоры. Одним из характерных признаков является снижение ее антагонистических свойств. Кишечная палочка часто утрачивает и ферментативную активность, подвижность. Гемолизирующие эшерихии, выделенные от лиц с дисбактериозом кишечника, обладают, как правило, токсическими (дермонекротическими) свойствами.
Имеющее место при нормальной микрофлоре расщепление поступающих из верхних отделов кишечника ферментов (энтерокиназы, щелочной фосфатазы), с их последующей реабсорбцией, не осуществляется в условиях дисбактериоза. Подтверждением этого является повышенное выделение с фекалиями этих ферментов, в частности энтерокиназы до 600 ед./г, в то время как у здоровых людей энтерокиназа в фекалиях отсутствует либо обнаруживается в виде следов (до 20 ед./г).
Дисбактериоз сопровождается нарушением содержания в организме
витаминов, особенно группы B - тиамина (витамина B ), рибофлавина
1
(витамина B ), пиридоксина (витамина B ) и инозита, что, как
2 6
известно, отрицательно влияет на течение физиологических процессов
и общую реактивность организма. Недостаток витаминов, в частности
группы B, при дисбактериозе является одним из факторов,
способствующих исчезновению активных симбионтов, нуждающихся в
витаминах этой группы, и, с другой стороны, бесконкурентного роста
микробов, не нуждающихся в них для своего развития, например
стафилококка, микробов рода протея, грибов рода кандида.
Таким образом, при дисбактериозе имеет место не только нарушение нормальных соотношений различных морфологических групп энтеробактерий, но с этим связаны и функциональные отклонения.
Что касается количественных сдвигов в анаэробной микрофлоре, то они еще более выражены, чем в аэробной. Так, например, при дисбактериозе у больных хроническим колитом B. bifidum вовсе не обнаруживаются у подавляющего числа обследованных, в то время как резкое снижение кишечной палочки (менее 1 млн. в 1 г испражнений) имеет место лишь в 16% проб.
Нарушение экологических соотношений в кишечнике в сторону высокого содержания микроорганизмов, которые в норме встречаются только спорадически, в небольших количествах, приводит к нарушению уравновешенной системы, что и является патогенетическим фактором определенного числа регистрируемых кишечных заболеваний. Кроме того, организм лишается физиологического барьера в кишечнике как одного из факторов естественной резистентности.
Дисбактериоз может протекать при отсутствии клинической симптоматики (компенсированная форма), так и вызывать дисфункцию кишечника. В первом случае организм сам уравновешивает возникшие нарушения качественного и количественного состава нормальной микрофлоры и расстройства пищеварительной функции не происходит. Развитие декомпенсированных форм дисбактериоза в большой мере зависит от снижения реактивности организма, что особенно касается грудных детей, а также ослабленных детей старшего возраста и взрослых лиц.
Дисфункция кишечника на фоне дисбактериоза требует применения для восстановления нормального биоценоза кишечника бактериальных препаратов из микробов-антагонистов - представителей нормальной микрофлоры.
Первый отечественный бактерийный препарат колибактерин представляет собой живую культуру высокоактивного штамма-антагониста E. coli M17. В настоящее время имеются бактерийные монопрепараты другого состава - бифидумбактерин, лактобактерин. Бифидумбактерин представляет живую культуру бифидобактерий (штамм I B. bifidum), составляющих основную микрофлору новорожденных детей и постоянного представителя анаэробной микрофлоры детей старшего возраста и взрослых людей. Лактобактерин представляет живые культуры L.B. fermenti и L.B. Plantarum - представителей молочнокислых бактерий, постоянных обитателей кишечника здоровых детей и взрослых.
Исходя из положения, что при дисбактериозе часто нарушается как аэробная, так и анаэробная микрофлора, разработан комплексный биопрепарат бификол, содержащий в своем составе бактерии E. Coli штамм М17 и штамм B. bifidum I.
Все названные препараты эффективны при лечении кишечных заболеваний на фоне дисбактериоза у взрослых и детей. Эффективность особенно демонстративна при лечении больных хроническими кишечными расстройствами (в том числе хроническим постдизентерийным колитом), которые в течение длительного времени безрезультатно лечились антибиотиками и другими препаратами. Перспективность этих препаратов повышается отсутствием побочного действия.
Содержащиеся в биологических препаратах микробы-антагонисты способствуют угнетению или полному вытеснению из кишечника патогенных и условно-патогенных микробных видов, микробных ассоциаций, не закрепленных в процессе эволюции в кишечнике, а следовательно, не связанных с физиологическими функциями пищеварительного тракта.
3. МЕТОДИКА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Учитывая роль дисбактериоза в поддержании длительной дисфункции кишечника, бактериологические исследования фекалий должны быть направлены в настоящее время не только на обнаружение патогенных энтеробактерий (шигелл, сальмонелл), но и на определение состояния микрофлоры кишечника. Ниже приведена общая схема исследования на обоих направлениях (см. Приложение).
Как видно из представленной схемы, 1 г нативных фекалий без
консерванта растирают в ступке с 9 мл физиологического раствора
-1
(10 ). Из этого разведения делают посев на плотные питательные
среды, обычно применяемые для выделения патогенных энтеробактерий
(среду Плоскирева, среды Плоскирева или Левина с синтомицином или
другим антибиотиком). Одновременно делают массивный посев из
нативного кала на жидкие среды обогащения (Мюллера, селенитовую,
магниевую).
Из основного разведения 1:10 делают дополнительные 100-кратные
-3 -5
разведения в физиологическом растворе до 10 - 10 , затем из
-5
пробирки, в которой фекалии разведены до 10 , вносят по 0,1 мл на
поверхность среды Эндо, Левина, Сабуро и 0,01 мл на 3 - 5%
кровяной агар. Посев испражнений для обнаружения патогенных грибов
можно также проводить на рисовой, картофельной и других
применяемых в лаборатории питательных средах. Для получения роста
изолированных, доступных для счета, колоний применяют стеклянные
бусы.
Стеклянные круглые бусинки (заранее простерилизованные по 10 - 12 штук в пробирке) опускают в чашку с посевным материалом. При легком покачивании чашки с бусами в течение одной минуты материал равномерно распределяется по питательной среде. Посев бусами начинают со среды, на которой посеяно наибольшее разведение материала, т.е. с кровяного агара, а затем бусы переносят на чашки с другими средами.
Для посева на бифидобактерии делают дополнительно еще 2 - 3
-7 -9 -11
разведения до 10 - 10 - 10 . В первую пробирку с 9 - 10 мл
-7
среды Блаурокк вносят 1 мл из разведения фекалий 10 , во вторую -
0,1 мл из этого же разведения, в третью и четвертую пробирку
-9
вносят соответственно по 1,0 и 0,1 мл из разведения 10 , а в
-11
пятую и шестую - по 1,0 и 0,1 мл из разведения 10 . Все среды,
за исключением среды Сабуро, помещают в термостат при температуре
37°.
Через 20 - 22 часа на среде Эндо подсчитывают число и процент лактозонегативных (бесцветных) колоний по отношению ко всему числу выросших колоний. Колонии со слабо выраженными ферментативными свойствами (слабое разложение лактозы - розовые колонии) подсчитывают по отношению к общему числу колоний кишечной палочки. Например: на среде Эндо выросли 50 лактозонегативных колоний при посеве 0,1 мл фекалий из разведения 1:100000. При расчете следует 50 умножить на 10, а затем на 100000 (степень разведения). Следовательно, в 1 г фекалий будет 50000000 лактозонегативных энтеробактерий.
С чашек со средами Эндо, Левина, Плоскирева выделяют не менее 4 - 5 колоний, отличающихся по морфологии, окраске на среды Рессела с мочевиной и солью Мора или на среду Олькеницкого, а также в пробирку с бульоном, под пробку которой подвешена индикаторная бумажка для определения индола. В дальнейшем лактозонегативные культуры изучают прежде всего в отношении принадлежности к патогенным энтеробактериям по действующей инструкции МЗ СССР, 1967 г.
Родовой состав лактозоотрицательных энтеробактерий, не относящихся к патогенным микробам семейства кишечных, может быть определен с помощью тестов, рекомендованных Всесоюзным центром по эшерихиям (1973). Вместе с тем для выявления дисбактериоза можно не детализировать родовой состав лактозонегативных бактерий, а ограничиться определением на среде Эндо общей суммы лактозонегативных колоний.
Рост микробов рода протея характеризуется разложением мочевины и окрашиванием среды Рессела в фиолетово-коричневый цвет при индикаторе тимоловый синий + кислый фуксин или оранжевый при индикаторе ВР, на среде Олькеницкого - в оранжевый цвет.
На 3 - 5% кровяном агаре учитывают процентные соотношения колоний кишечной палочки, обладающих и не обладающих гемолизирующими свойствами; соотношения колоний кишечной палочки и кокковых форм; соотношения гемолизирующих и негемолизирующих кокков. Количество в 1 г фекалий указанных групп микробов учитывают, как это было указано, на среде Эндо.
С 5% кровяного агара пересевают колонии разного вида на скошенную поверхность слабощелочного агара. После 20 - 22-часовой инкубации в термостате при 37° проводят микроскопию окрашенных по Граму мазков. Культуры стафилококка проверяют в реакции плазмокоагуляции и в отношении лецитиназной активности на желточно-солевом агаре.
Для определения плазмокоагуляции петлю агаровой культуры стафилококка вносят в пробирку с 1 - 2 мл стерильной кроличьей или человеческой плазмы, разведенной 1:5 <*>. Посевы помещают в термостат и проверяют результат через 30 минут, 2 - 4 и 24 часа. В качестве контроля ставят пробирки с плазмой без добавления культуры и с плазмой, в которую посеян заведомо коагулирующий стафилококк. При свертывании плазма полностью уплотняется или в пробирке плавает сгусток.
--------------------------------
<*> Можно пользоваться сухой плазмой, выпускаемой Минским институтом эпидемиологии и микробиологии.
Для определения лецитиназной активности делают посев секторами на чашку с желточно-солевым агаром (на одну чашку можно посеять 4 - 8 культур). Посев инкубируют 24 - 48 часов при 37°, после чего учитывают результат. Лецитиназоположительной считают культуру, вокруг которой образуется радужный венчик.
Для дифференциации энтерококка от прочих диплококков и диплострептококков применяют следующие тесты: способность расти и редуцировать метиленовую синьку в молоке, как наиболее надежный тест, рост в бульоне с 40% желчи, расщепление маннита, терморезистентность (выживание при прогревании при 60° 30 минут).
С целью обнаружения патогенных грибов посевы на среде Сабуро инкубируют в течение 3 - 5 дней при 28 - 30°, выделяют плотные непрозрачные колонии в пробирки со скошенной поверхностью этой же среды. Посевы снова выдерживают в термостате при той же температуре 3 - 4 суток, после чего проводят микроскопию препарата из живой культуры в капле стерильной водопроводной воды при помощи объектива 40, окуляра 10. К патогенным грибам относят культуры почкующихся клеток при наличии длинных нитей мицелия (псевдомицелий) или более коротких нитей (истинный мицелий).
Для определения анаэробных бифидобактерий посевы на среде Блаурокк выращивают при 37° в течение 48 часов. Из посевов, в которых виден рост в виде помутнения всей среды, в виде отдельных колоний или тяжей, готовят окрашенные по Граму мазки. Обнаружение характерных грамположительных палочек с разветвлениями на концах, расположенных в виде римской цифры V, с несколько утолщенными концами или в виде скоплений, напоминающих китайские иероглифы, подтверждает их принадлежность к бифидобактериям. При отсутствии роста через 48 часов посевы оставляют в термостате до 72 часов.
Выделение чистой культуры B. bifidum является весьма трудоемким и практически необязательным, так как определение разведения, в котором обнаруживают B. bifidum, является вполне достаточным для оценки нормального или пониженного их содержания в фекалиях.
Исследования указанных представителей кишечной микрофлоры не исчерпывает весь биоценоз кишечника, тем не менее позволяет выявить нормальное или нарушенное состояние кишечной микрофлоры.
Для количественного определения содержания кишечной палочки
штамма М17 у лиц, получавших колибактерин или бификол, проводят
-5
дополнительный посев 0,1 мл из разведения 10 (см. схему) на
чашку со средой Эндо, в которой 1% лактозы заменен 1% сахарозы
<*>. После 20 - 22 часовой инкубации при 37° на указанной среде
определяют процентное соотношение колоний, расщепляющих сахарозу
(кишечная палочка М17 сахарозоположительная), к общему числу
выросших колоний кишечной палочки. Для окончательного суждения о
принадлежности выросших колоний к кишечной палочке штамма М17
необходимо испытать не менее 8 - 10 сахарозоположительных колоний
в реакции агглютинации на стекле с сывороткой против кишечной
палочки М17 <**>, разведенной в 10 раз. Этот тест является
показателем как степени заселения кишечника штаммом М17 при
приеме препарата, так и длительности приживления этого штамма
после прекращения лечения колибактерином или бификолом.
--------------------------------
<*> Рецепт среды - см. Приложение.
<**> Сыворотку можно заказать в Московском институте эпидемиологии и микробиологии Минздрава РСФСР.
В процессе лечения кишечная палочка штамма М17 составляет обычно 30 - 50% по отношению к облигатным кишечным палочкам фекалий. О положительном влиянии примененного препарата на содержание бифидофлоры можно судить по количественному нарастанию таковой в кишечнике.
Существенные сдвиги микрофлоры в направлении нормализации регистрируются через 12 - 15 дней после приема бактерийных препаратов, в отдельных случаях для стойкого восстановления нормального биоценоза необходим более длительный срок - до 2 - 3 месяцев.
4. КРИТЕРИИ УСТАНОВЛЕНИЯ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА
И ФОРМУЛИРОВКА ОТВЕТА
Правильная трактовка результата бактериологического исследования имеет исключительно большое значение для эпидемиолога, а также клициниста при решении вопроса о природе кишечного заболевания и, соответственно, методах лечения, а именнолибо этиотропного характера, либо направленных на нормализацию кишечной микрофлоры.
При выдаче результата исследования необходимо указать наличие или отсутствие в посеве фекалий патогенных энтеробактерий (шигелл, сальмонелл), а также дать описание состава кишечной микрофлоры.
Показателем дисбактериоза являются отклонения от нормальной микрофлоры человека, описанной выше. Дисбактериоз может выражаться высоким удельным весом кишечной палочки со слабо выраженными ферментативными свойствами (> 10%), лактозонегативных энтеробактерий (> 5%), наличием гемолизирующих эширихий, микробов рода протея, грибов рода кандида, большим процентным содержанием стафилококка. В подавляющем большинстве случаев при дисбактериозе имеет место как ассоциация ряда условно-патогенных микробов, не характерных для нормального биоценоза, так и одновременно качественные изменения эшерихий (гемолиз, снижение ферментативной активности, потеря подвижности).
Весьма показательными для нарушенного биоценоза кишечника
являются также количественные сдвиги облигатной микрофлоры -
отсутствие роста бифидобактерий в минимальном разведении фекалий
-7
(10 ) и резкое снижение числа кишечной палочки (менее 1 млн./г).
В процессе лечения любым из названных бактерийных препаратов
восстанавливается облигатная как аэробная, так и анаэробная
микрофлора, а ассоциации микроорганизмов, характерные для
дисбактериоза, исчезают. К концу 2 недели лечения число
-11
бифидобактерий достигает высоких цифр (10 ). К этому сроку
имеет место нарастание в посевах лактозопозитивных колоний
кишечной палочки полноценной в ферментативном отношении, активно
подвижной.
С другой стороны, резко снижается в первые две недели лечения число лиц, у которых выделяется кишечная палочка с гемолизирующими свойствами, слабыми ферментативными свойствами, лактозонегативные эшерихии, микробы рода протея, грибы рода кандида. Наибольшая стойкость выделения в эти сроки сохраняется у стафилококка как негемолизирующего, так особенно гемолизирующего.
Весьма характерным признаком для суждения о положительном влиянии бактерийного препарата на микрофлору кишечника - это менее пестрый состав ее, отсутствие широких ассоциаций многих родов и видов микробов, отмеченных до лечения.
Образец выдачи результата бактериологического исследования кишечной микрофлоры.
Результат бактериологического исследования фекалий
От 197_ г. анализ N
Фамилия, и.о.
Анализ первичный, повторный (подчеркнуть)
Учреждение
┌───┬─────────────────────────────────────┬───────────┬──────────┐
│ │ Микрофлора │ Норма │У больного│
├───┼─────────────────────────────────────┼───────────┼──────────┤
│1. │Патогенные микробы семейства кишечных│- │ │
├───┼─────────────────────────────────────┼───────────┼──────────┤
│2. │Общее количество кишечной палочки │300 - 400 │ │
│ │ │млн./г │ │
├───┼─────────────────────────────────────┼───────────┼──────────┤
│3. │Кишечная палочка со слабо выраженными│до 10% │ │
│ │ферментативными свойствами │ │ │
├───┼─────────────────────────────────────┼───────────┼──────────┤
│4. │Лактозонегативные энтеробактерии │до 5% │ │
├───┼─────────────────────────────────────┼───────────┼──────────┤
│5. │Гемолизирующая кишечная палочка (в %)│О │ │
├───┼─────────────────────────────────────┼───────────┼──────────┤
│6. │Кокковые формы в общей сумме микробов│до 25% │ │
├───┼─────────────────────────────────────┼───────────┼──────────┤
│7. │% гемолизирующего стафилококка │О │ │
│ │по отношению ко всем кокковым формам │ │ │
├───┼─────────────────────────────────────┼───────────┼──────────┤
│ │ │ -7 │ │
│8. │Бифидобактерии │10 и выше│ │
├───┼─────────────────────────────────────┼───────────┼──────────┤
│9. │Микробы рода протея │О │ │
├───┼─────────────────────────────────────┼───────────┼──────────┤
│10.│Грибы рода кандида │О │ │
├───┼─────────────────────────────────────┼───────────┼──────────┤
│11.│Кишечная палочка М17 у лиц, леченных │О │ │
│ │колибактерином, бификолом (в %) │ │ │
└───┴─────────────────────────────────────┴───────────┴──────────┘
Дата выдачи ответа
Врач
Примеры оценки результата состояния микрофлоры кишечника:
Дисбактериоз не выявлен.
Дисбактериоз выявлен и характеризуется: преобладанием
гемолизирующей кишечной палочки или других условно-патогенных
микробов (...%), ассоциацией лактозонегативных энтеробактерий
(...%), гемолизирующего стафилококка (...%), наличием микробов
рода протея, грибов рода кандида; отсутствием B. bifidum в
-7
минимальном разведении фекалий (10 ).
При повторном исследовании необходимо отразить положительные
или отрицательные сдвиги по сравнению с предыдущими
исследованиями:
А. По сравнению с исследованием фекалий от ... числа имеются
положительные сдвиги в аэробной микрофлоре кишечника: увеличение
числа полноценной кишечной палочки (...%), уменьшение или
исчезновение палочковидной и кокковой гемолизирующей микрофлоры -
-8
(...%) и т.д. B. bifidum обнаружены в разведении фекалий от 10
-11
до 10 .
Б. По сравнению с исследованием фекалий от ... числа
положительных сдвигов в микрофлоре кишечника не отмечено:
увеличился процент (до ...) гемолизирующей кишечной палочки,
обнаружены грибы рода кандида либо другие роды (группы) аэробных
микробов, характеризующих дисбактериоз. B. bifidum в минимальном
-7
разведении фекалий (10 ) не обнаружены.
Приложение
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
1. Желточно-солевой агар.
а) Солевой агар.
В качестве питательной основы можно использовать питательный агар, к которому добавляют хлористый натрий из расчета 7,5% pH - 7,2 - 7,4.
Среду разливают и стерилизуют при 110° 30 минут. Среда может храниться в течение 1 - 1,5 месяца в холодильнике.
б) Желточная взвесь.
Желток куриного яйца отделяют от белка и переносят во флакон (желательно с бусами), куда постепенно при постоянном перемешивании добавляют 150 - 200 мл стерильного физиологического раствора. Смесь тщательно суспендируют. Желточную взвесь можно хранить в холодильнике не более 1 - 3 суток.
в) Желточно-солевой агар.
В растопленный и остуженный до 45 - 50° солевой агар добавляют 10 - 20% по объему стерильной желточной взвеси. Чашки с желточно-солевым агаром можно хранить в холодильнике в течение 1,5 - 2 недель.
2. Молоко с метиленовым синим.
К 100 мл обезжиренного молока добавляют 10 мл 1% водного раствора метиленового синего (0,1%). Среду разливают по пробиркам и стерилизуют 2 дня подряд текучим паром до 30 минут. Среду следует ставить в автоклав, предварительно прогретый до 100°.
3. 40% желчный бульон.
К 60 мл питательного бульона прибавляют 40 мл бычьей желчи, разливают в пробирки, стерилизуют при давлении 1 атм. в течение 10 минут.
4. Агаровая среда Сабуро.
К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1% пептона, 1,8% мелко нарезанного агар-агара и оставляют на 20 - 30 минут до его разбухания. Затем помещают в автоклав, нагревают до 120° (давление 1 атм.). Автоклав выключают до падения давления, агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр и добавляют 4% мальтозы или глюкозы. Среду разливают во флаконы или пробирки и стерилизуют при 115° 15 минут.
5. Среда Эндо с сахарозой.
К 100 мл 3% остуженного мясопептонного агара добавляют 1% сахарозы и 0,5 мл 10% спиртового раствора основного фуксина (фуксин основной для фуксиносернистой кислоты), обесцвеченного добавлением 0,8 мл 10% раствора сернистокислого натрия (сернистокислый натрий готовят ex tempore).
6. Модифицированная среда Блаурокка.
а) Для приготовления печеночного отвара 500 г говяжьей печени кипятят в 1 л дистиллированной воды в течение 2 часов. После фильтрации количество отвара доводят до 1 литра дистиллированной водой.
б) К 1 литру печеночного отвара добавляют при нагревании 10 г пептона, 5 г NaCl, 750 мг агар-агара. Устанавливают pH - 7,8 - 7,9, кипятят в течение 15 минут, фильтруют через бумажный фильтр. Затем добавляют 10 г лактозы, 100 мг L-цистеина солянокислого. Среду доводят до первоначального объема горячей дистиллированной водой и разливают во флаконы по 50 - 100 мл. Стерилизуют дробно при 100° 3 дня подряд по 45 минут или однократно при 110° (0,5 атм.) 30 минут, pH среды после стерилизации равен 7,4. Перед употреблением среду разливают в пробирки по 10 мл и регенерируют кипячением в течение 40 - 45 минут.